Cromatografia per Gel Filtrazione

Questa tecnica cromatografica liquido-liquido viene anche definita cromatografia di esclusione molecolare e viene usata per separare i vari componenti di una miscela in funzione delle loro dimensioni molecolari. Come fase stazionaria vengono usati i Sephadex®, sostanze di natura polisaccaridica (destrani) che formano dei reticoli tridimensionali.

I Sephadex® si presentano come delle piccole sferette (dell’ordine dei decimi di mm) e data la loro natura chimica contengono un gran numero di gruppi idrossilici. Questo conferisce loro una grande affinità per l’acqua, infatti quando i Sephadex® vengono trattati con acqua o con soluzioni elettrolitiche si rigonfiano per dare un gel trasparente.

Il reticolo di destrano rende le sferette porose; all’interno di queste vi sono dei canali dove si inseriscono le molecole di acqua. Il processo cromatografico si realizza attraverso i seguenti passaggi:
– si carica la miscela da separare alla sommità di una colonna entro cui si trova il gel. Facendo scorrere la fase mobile (acqua o soluzione tampone) le varie sostanze della miscela, in funzione della loro dimensione molecolare, si inseriranno all’interno dei canali oppure, se le loro dimensioni sono al di sopra del cosiddetto limite di esclusione, non riusciranno ad inserirsi all’interno dei suddetti canali e verranno trascinate dall’eluente attraverso gli interstizi che si sono formati tra le sferette.

Le particelle più piccole s’inseriranno dentro i canali del gel in modo variabile in funzione della dimensione e della forma, si avrà una ripartizione delle molecole fra liquido all’interno delle sferette e del liquido all’esterno. Le varie sostanze man mano che si eluisce usciranno dalla colonna in ordine di peso molecolare decrescente.

Questa tecnica viene riportata anche sotto il nome di permeazione su gel, esclusione molecolare  o setacciatura molecolare. Il campo di frazionamento dipende dalla dimensione dei pori delle particelle, che a loro volta sono inversamente proporzionali alla quantità di agente usato per provocare i legami traversi.

I vari tipi di gel vengono caratterizzati in funzione dei loro valori di riassorbimento di acqua, che definiscono la quantità di acqua (in ml) che viene assorbita da un grammo di granuli di gel secco. Nel caso del Sephadex® e Bio-Gel® i numeri caratteristici corrispondono a dieci volte il valore di riassorbimento d’acqua.

Per esempio, Sephadex G-10 ha un valore di riassorbimento uguale a uno e Sephadex G-200 ha un valore di riassorbimento uguale a venti. In questi valori non si tiene conto dell’acqua che eventualmente staziona tra un granulo e l’altro.

I tipi di Sephadex® con piccoli valori di riassorbimento possiedono pori a piccole dimensioni, quindi buoni per il frazionamento di molecole piccole. Mentre i tipi con grandi valori di riassorbimento vengono usati per composti ad alto peso molecolare.

Riferendosi ai Sephadex presi come esempio, G-10 fraziona sostanze con pesi molecolari sino a 700, G-200 fraziona sostanze con pesi molecolari compresi tra 5000 e diverse centinaia di migliaia (proteine globulari, peptidi, etc.).

Nel caso si volessero separare sostanze con pesi molecolari molto alti (polisaccaridi, acidi nucleici, virus, ecc.), le dimensioni dei pori devono essere più grandi e a questo scopo i granuli vengono preparati con un polisaccaride, l’agarosio, una macromolecola derivata dall’agar.

Uno dei vantaggi di questa tecnica é legato al fatto che i volumi di eluizione sono correlabili al peso molecolare, cioè si può considerare che il volume di eluizione sia una funzione praticamente lineare del logaritmo del peso molecolare.

Supponendo di fare un frazionamento con un particolare tipo di Sephadex, usando una miscela di proteine a peso molecolare noto, corrisponderà ad ogni gruppo di frazioni di eluito una particolare proteina. La separazione procederà dalla proteina a peso molecolare maggiore alla proteina a peso molecolare minore e in questo modo i vari gruppi di frazioni di eluito discrimineranno le varie proteine in funzione del loro peso molecolare.

Costruendo sperimentalmente una curva di taratura per proteine di cui si conosce il peso molecolare, é possibile determinare il peso molecolare di proteine non conosciute sulla base dei volumi raccolti.

E’ possibile estendere questa tecnica alle separazioni con solventi non acquosi. In questo caso i gruppi ossidrilici del destrano vengono bloccati con gruppi idrofobi e il rigonfiamento dei granuli si avrà per trattamento con solventi organici. Un altro prodotto adatto per questo tipo di cromatografia é un derivato del polistirolo con legami traversi.

 

 

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