Librerie di DNA
Le strategie di base per il clonaggio consistono in tre tappe:
Scelta del DNA da usare per il clonaggio (DNA cromosomico o cDNA, complementare al m-RNA, che non presenta la sequenza intronica).
Frammentazione del DNA con enzimi di restrizione, creando una libreria genica o genoteca (che può essere genomica o a cDNA).
Screening della libreria attraverso l'uso di sonde oligonucleotidiche, anticorpi specifici o saggi di funzionalità della proteina.
Le strategie di base per il clonaggio consistono in tre tappe:
Scelta del DNA da usare per il clonaggio (DNA cromosomico o cDNA, complementare al m-RNA, che non presenta la sequenza intronica).
Frammentazione del DNA con enzimi di restrizione, creando una libreria genica o genoteca (che può essere genomica o a cDNA).
Screening della libreria attraverso l'uso di sonde oligonucleotidiche, anticorpi specifici o saggi di funzionalità della proteina.
Una cosa improtante nella creazione di una libreria genomica è la creazione di frammenti di restrizione sovrapponibili attraverso la digestione parziale con SauIII. Con questo metodo si ottengono frammenti di 20kB, parzialmente sovrapponibili, dovuti alla digestione da parte dell'enzma SauIII.
Per costruire una libreria di cDNA si deve inizialmente estrarre l'RNA totale, da cui si isola il m-RNA; da esso si sintetizza il cDNA usando un primer di oligotimidine e la trascrittasi inversa. L'ibrido DNA-RNA viene denaturato bollendolo o idrolizzando il m-RNA in ambiente alcalino.
La trascrittasi inversa ha la proprietà di terminare la trascrizione con un loop a forcina; utilizzando la DNA polimerasi I, nucleotidi e ioni Mg2+, si può estendere il frammento di klenow per ottenere un cDNA a doppio filamento; il loop viene digerito da una Dnasi S1. Un'alternativa utilizza la RNasi H per degradare il m-RNA ed i frammenti che rimangono possono avere funzione di primer per la DNA polimerasi I; i frammenti di DNA appena sintetizzato saranno poi uniti dalla DNA ligasi.
