Amplificazione del Segnale

Di seguito descriviamo due metodiche su come amplificare il segnale in laboratorio, tramite target e tramite la sonda.

AMPLIFICAZIONE DEL TARGET: Più intuitiva, si attua tramite una PCR quindi ha sensibilità elevata, un'elevata specificità, è rapida, può essere allestita mediante PCR convenzionale oppure modifiche della PCR classica tra cui la SDA.

Di seguito descriviamo due metodiche su come amplificare il segnale in laboratorio, tramite target e tramite la sonda.

AMPLIFICAZIONE DEL TARGET: Più intuitiva, si attua tramite una PCR quindi ha sensibilità elevata, un'elevata specificità, è rapida, può essere allestita mediante PCR convenzionale oppure modifiche della PCR classica tra cui la SDA.

Una volta effettuata la PCR si fà la verifica con il gel d'agarosio, la prsenza del bromuro d'etidio che ci permette di vedere la banda del DNA perchè carico positivamente si intercala nel DNA. Un passo successivo è verificare la PCR ovvero un'ibridazione sul prodotto di PCR, aggiungere uno step in più di specificità ed in questo caso la sonda può essere immobilizzata con una strisciolina su substrato, si aggiunge l'amplicone che può essere marcato in modo tale da consentirne la rilevazione, in questo caso con sistema biotina streptavidina coniugata con una perossidasi che manifesta l'avvenuta PCR con la formazione di un colore, aggiungendo un substrato cromogeno visualizzerò una banda colorata evidenziabile.

Variazioni della PCR:
a) Multiplex
Andiamo a cercare una sequenza specifica di più microrganismi di più speci (3-4 microrganismi massimo perchè critica la costruzione del primer e le condizioni di allestimento).
Condizioni da realizzare:
• in unica PCR devo farli funzionare tutti insieme quindi molto simili i primer
• lavorare nelle stesse condizioni
• margine che quando andiamo a correre si siano amplificati frammenti di peso diverso altrimenti bassa discriminazione
b) Nested
2 coppie di primer utilizzate prima quelli più esterni per frammenti di dimensioni maggiori che servirà da stampo per i primer che vanno verso l'interno del frammento.
Avendo due step di PCR ci sono problemi di contaminazione anche se più specifica.
Inno Lipa
Si scelgono come sequenze bersaglio le sequenze spaziatrici posizionate tra i geni del rna ribosomiale perchè conservate ma buona variabilità tra le varie specie.

Fasi di questa metodica:
• estrazione DNA genomico
• amplificazione di queste sequenze con primer marcati con biotina perchè questa è una di quelle tecniche che prevedono una conferma di avvenuta PCR che viene chiamata ibridazione inversa.
• migrazione elettroforetica di controllo
• faccio un'ibridazione che sarà proprio la chiave per la discriminazione delle varie specie perchè magari la migrazione elettroforetica non mi basta per discriminare le specie perchè magari frammenti di specie diverse della stessa dimensione, quindi uso delle striscioline con sonde specie-specifiche delle sequenze spaziatrici per esempio controllo coniugazione o complesso MAIS. L'esigenza di discriminare c'è bisogno perchè ci sono forme associate nei bambini che sono più presenti come il micobacterium avium rispetto all'adulto dove è più presente il micobacterium tubercolare.
• Nel frattempo mi sono preparato l'amplicone, il primer è marcato con biotina, il mio amplicone è marcato, il mio prodotto di PCR viene ibridato sulla strisciolina e si legherà solo dove è presente la sonda specie-specifica di quel microrganismo basterà aggiungere la streptavidina coniugata con la perossidasi, fornire il substrato ed avrò la precipitazione di un prodotto cromogeno e l'evidenziazione della banza in corrispondenza della barretta a cui si è legato.
• C'è più di una banda come controlo della coniugazione (per efficacia reazione rivelatrice) e la seconda barretta genere micobacterium altrimenti vuol dire che ho amplificato qualcos'altro, quindi non sarà una sequenza ITS ma che riconsoce tutto il genere, quindi il primer che faccio sarà per le ITS e la regione specie-specifica, poi otterrò una banda diversa a secodna del bacillo identificato. Nelle barrette non c'è il micobacterium tubercolosis ma solo l'MTB complex quindi solo il complesso tubercolare comprende anche il micobacterium bonem perchè danno una patologia sovrapponibile mentre è importante discriminare il complesso tubercolare dal complesso MAIS perchè casistica diversa e spettro d'ospite diverso.

Però questo tipo di strisciolina è in continua evoluzione, sono state scoperte nuove specie.

Riassunto delle sonde:
• Sonde di genere
• Sonde di specie
• Sonde intraspecifica cioè evidenzia genotipi diversi pure appartenendo alla stessa specie (quindi alto livello di discriminazione)

La versione due aggiornata con tutta una serie di sonde nuove e che consentono l'identificazione di un numero crescente di specie.

 

 

 

AMPLIFICAZIONE DELLA SONDA: Un esempio classico è la LCR, Il principio su cui si basa questa tecnica è l'impego di due primer che devono essere marcati in maniera diversa che devono appaiarsi sulla sequenza target in modo da lasciare un piccolissimo gap tra i due, che verrà riempito dalla DNA ligasi che unirà i due primer che hanno estremità diverse sulla base dello stampo del filamento da analizzare.

Le due molecole costituiranno lo stampo per la denaturazione, apaiamento di altre due molcole di primer marcate in modo diverso che devono stare vicine in modo da lasciare un solo nucleotide, e la rilevazione avviene perchè sono presenti delle sferette rivestite con anticorpi diretti verso una delle due estremità contro uno solo dei gruppi con cui ho marcato il primer iniziale e succede che se nel mio campione era presente la sequenza specifica per entrambi i primer la ligasi li avrà uniti e la sfera avrà legato sia un'estremità (ligando) che l'altra (il rilevatore) se la reazione non è avvenuta la sferetta legherà solo un'estremità e l'altra no, sarà libera e non avrò alcun segnale perchè il resto è lavato via non è trattenuto dalle sferette.

Questa è una delle tecniche più utilizzate per l'analisi di chlamidia o per il plasmodio.
Altra tecnica: è una LCR modificata applicata ad un sistema rilevatore con elettroforesi capillare, cioè una LDR (ligase detection reaction). I primer sono marcati ed amplificano una regione che abbiamo scelto che pur essendo conservata ma variabile, viene amplificata utilizzando primer universali, dopodichè utilizzo primer che hanno posizioni degenrate o meglio che sono in grado di appaiarsi diversamente se nella mia sequenza bersaglio ci sono degli SNIP (singolo nucleotide modificato).

Questa tecnica oltre a identificare quella determinata specie mi consente di scendere u ngradino sotto e di evidenziare un polimorfismo intraspecifico. Si utilizza primer, dopo i primer universali per amplificare, che funzionano come prima, ma mi consentono di rilevare degli SNIP uso due coppie modificate in mdoo tale da avere un nucleotide di differenza rispetto al primo quindi marcati anche diversamente.

Se nella mia sequenza stampo c'è una G si legherà il primer con la C se nella mia sequenza stampo ha una T si legherà una A. Posso discriminarli perchè sono marcati in maniera diversa. Posso farlo sulla stessa specie o su specie diverse.

 

 

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