Caratteristiche Target Molecolari
• Gene presente in tutti i batteri
• Sequenze conservate
• Regioni di eterogeneità
• Database completo ed affidabile
• Gene presente in tutti i batteri
• Sequenze conservate
• Regioni di eterogeneità
• Database completo ed affidabile
IDENTIFICAZIONE TRAMITE SEQUENZIAMENTO
VANTAGGI
• Veloce
• Oggettivo
• Metodo aperto (Identificazione di specie inusuali che magari ancora non sono nel database)
SVANTAGGI
• Personale
• Strumentazione/costo
Quali sono alcuni dei geni conservati ed usati per il sequenziamento:
• Gene p65 (proteine da shock termico)
• Gene Superossido Dismutasi
• Regione spaziatrice 16S-23S
Anche il pirosequencing può essere utilizzato per l'identificazione un esempio è stato usato per l'identificazione di 3 specie del genere candida che non sono distinguibili fenotipicamente e distinguibili con metodiche molecolari come il pirosequencingcon regioni ITS (regioni spaziatrici).
Microarray sono disponibili di molti tipi: Bacillus Antracis, HIV, Papilloma virus, etc.
Non solo batteri e virus ma anche protozoi come il plasmodium della malaria.
Un lavoro pisano permette tramite microarray di trovare varianti del papilloma virus tramite la tecnica Apex.
C'è un nuovo microarray per le specie patogene del genere clostridium, in questo caso si costruisce a tavolino solo un numero limitato di sonde che riconosce specie diverse di clostridium.
Nel 2007 un microarray panmicrobico per la diagnosi delle malattie infettive, ci sono 30 mila sonde spottate su questo vetrino in grado di riconoscere virus per i vertebrati, batteri funghi e parassiti come i protozoi.
In realtà questo tipo di vetrino si presta che garantisce una sorveglianza microbiologica dal punto di visto dellaq diagnostica di patologie pericolose per un'intera nazione, inoltre rileva virus del quale non è ancora disponibile in banca dati perchè ha la possibilità di staccare il prodotto di PCR dal substrato e di sequenziarlo in un secondo momento.
I metodi per la diagnostica micologica sono molto lenti.
I funghi possono essere sia unicellulari come i lieviti che crescono molto rapidamente che pluricellulari come le tigne causate da dermatofiti che impiegano anche 3 settimane per crescere ecco perchè importante l'uso dei test molecolari.
I microarray permettono di velocizzare la diagnosi.
Alcuni esempi di apllicazioni di metodiche molecolari che consentono di identificare due o tre alla volta per esempio le specie del genere aspergillus che danno micosi profonde ed infezioni polmonari e sistemiche oppure le specie più rilevanti del genere candida.
Idealmente cosa dovrebbe avere:
• semplicità
• riproducibilità
• consentirci di identificare facilmente il risultato quindi eliminando problemi di identificazione soggettiva
• facile da eseguire
• poco costoso
Anche i funghi unicellulari sono identificati basandosi sul loro profilo biochimico (diversa assimilazione di zuccheri).
Per i pluricellulari ancora oggi la diaagnosi si basa sull'osservazione microscopica delle strutture riproduttivo ma considerando che ci vogliono 3 settimane.
A volte con questo riconosco la specie altre volte solo il genere.
A votle ci vogliono più di 3 settimane perchè sono molto delicate le ife riproduttive quindi se si rompono non posso riconoscerle.
Le metodiche molecolari quindi riducono i tempi se applicate direttamente al campione clinico se devo aspettare la coltura non servono a granche.
2005 usando sequenze target ITS per riconoscere 12 specie e 2 fungine (aspergillus e candida)
2006 20 specie 8 generi.
2007 14 specie con 7 generi con approccio di creare vetrino ad hoc per il soggetto neutropenico (che ha pochi neutrofili immunodeficienza) che rischiano di contrarre più facilmente infezioni di tipo fungino, quindi spottate sequenze ITS in particolare però per quelli che colpiscono i soggetti neutropenici.
2008 arriva la prof con la sua equipe 24 specie e 10 generi includendo quelle 3 della candida che ha scoperto lei identificabili con questo sistema, semrpe sequenze ITS.
Le regioni ITS (ITS 1 e ITS2)
Sono frapposte nel DNA ribosomiale
La caratteristica di questa regione è che posso usare una sola coppia di primer per tutti i microrganismi.
Sono conservate ma variabili e possono essere amplificati con un unica coppia di primer chimati primer universali (ITS1 e ITS4).
