Clonaggio

Per clonaggio si intende creare ‘copie identiche’ (= CLONI) di un frammento di DNA che possono essere sfruttate per sintetizzare artificialmente delle proteine (insulina, aldosterone etc.).

clone

Frammento di DNA

Il  frammento di DNA da clonare viene isolato e tagliato con un opportuno enzima di restrizione.

Il gene isolato viene  inserito in  un vettore  di  clonaggio, cioè  una  molecola  di  DNA  naturale  o  artificiale:

  • un plasmide,
  • un cosmide

nel caso di clonaggio  di un frammento più grande:

  • un BAC (cromosoma artificiale batterico),
  • un  PAC (cromosoma artificiale plasmidico),
  • uno YAC (cromosoma artificiale di lievito).

Questi vettori si diversificano principalmente   in base alle dimensioni del frammento da clonare:

  • Plasmidi:  0.1 – 10Kb
  • Fagi: 8 – 22 Kb.
  • Cosmidi: 32 – 45 Kb.
  • BAC e PAC: 75 – 300 Kb.
  • YAC: 100 – 2000 Kb.

Vettore di clonaggio

Un  vettore di clonaggio deve avere determinate caratteristiche:

  • siti unici di restrizione  vicini  o  all’interno di  marker  genetici  la  cui espressione  viene  alterata all’inserzione di DNA estraneo;
  • un’origine di replicazione  “ori” a partire dalla quale si replica tutta la molecola di DNA (sia quella inserita sia quella del vettore) all’interno della cellula ospite;
  • un  marcatore  (generalmente  un  fattore  di  resistenza  ad  un  antibiotico,  come  l’ampicillina) che consente  successivamente  la  selezione,  su  opportuni  terreni  di  crescita, del le  cellule  che  hanno acquisito il frammento.

Il vettore di clonaggio deve essere digerito con lo stesso enzima utilizzato per il frammento di DNA da  clonare (in  modo  da  produrre  delle  estremità  complementari).  L’inserzione  del  frammento nel vettore avviene mediante gli enzimi topoisomerasi e ligasi producendo un “vettore ricombinante” o “molecola chimerica”.

Clonaggio di un gene

Per clonare un gene dobbiamo quindi inserirlo in un vettore di clonaggio ed introdurre  il  “costrutto”  risultante  in  un  ospite  capace  di  replicarlo. Le  cellule ospiti nelle quali  si inserisce il vettore ricombinante sono cellule batteriche , batteriofagi o fagi e vengono trasformate per consentire l’assorbimento del vettore:

Queste cellule   vengono poi coltivate su opportuni terreni selettivi al fine di selezionare solo quel le contenenti il costrutto.  Per costruire le banche  genomiche  si  usa un  approccio  del  tutto  simile,  solo  che  il  taglio  non  è limitato ad un gene, ma viene esteso a tutto il genoma. Il “Progetto Genoma”  è stato realizzato in parte proprio con questa tecnica.

Clonaggio del DNA

In Biologia, clonare un organismo significa ottenere da un individuo una popolazione di organismi geneticamente identici; in Biologia Molecolare clonare un tratto di DNA significa ottenere un insieme di molecole di DNA identiche a quelle di partenza. Ciò ha dato il via alla tecnologia del DNA ricombinante.

Il clonaggio del DNA può essere raggiunto attraverso due tecniche:

  • una in vivo, basata sulle cellule (E. coli);
  • una in vitro, chiamata PCR o reazione a catena della polimerasi. Nell’approccio basato su cellule è richiesto un vettore per portare il frammento di DNA d’interesse nella cellula ospite; il vettore può essere un plasmide o un virus.

Clonaggio tramite vettori

Un vettore è un agente che può portare un frammento di DNA in una cellula ospite; se usato per la riproduzione di frammenti di DNA è chiamato vettore di clonaggio, se è usato per l’espressione di geni contenuti nel DNA inserito viene chiamato vettore di espressione, i vettori di espressione contengono un promotore.

Vettore YAC

I vettori usati più comunemente includono plasmidi, fago lambda, cosmidi e il cromosoma artificiale del lievito (YAC).

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