Parassitosi

La  diagnosi di certezza di Leishmaniosi si ottiene normalmente con l’osservazione diretta di Leishmania infantum al microscopio ottico, utilizzando materiale proveniente da biopsia linfonodale o sternomielocentesi, strisciato su vetrini e colorato con Giemsa, ma in alcuni casi è possibile non ritrovare il parassita anche se il soggetto è infetto. Inoltre l’identificazione di Leishmania spp. da coltura (in terreno di Tobie Evans) richiede molto tempo.
Con le prove sierologiche (IF) non è sempre possibile una diagnosi certa, soprattutto nelle zone in cui la  Leishmaniosi  ha  carattere  endemico,  in  quanto  animali  sani  possono  risultare  sieropositivi  e animali infetti possono risultare sieronegativi  o comunque presentare titoli anticorpali troppo bassi perché siano individuati dal test.

Negli  ultimi  anni  sono  stati  messi  a  punto  protocolli  diagnostici  basati  sulla  PCR,  con  valori  di sensibilità/specificità pari al 100%. Questi risultati sono certamente migliori di quelli ottenibili con le prove sierologiche, con l’osservazione microscopica e con le prove colturali.
La  diagnosi  di Toxoplasmosi e di Neosporosi si effettua con  esami  istologici,  con  metodi immunoistochimici,  con  prove  biologiche  e  con  prove  immunologiche (dyetest,  FdC,  IFI,  ELISA, IHA per la Toxoplasmosi,  ELISA  per  la Neosporosi).

Si  tratta  di  metodiche  che  non  sempre permettono di  effettuare diagnosi di certezza: i campioni biologici vanno spesso incontro a rapida autolisi,  l’immunoistochimica  e le prove biologiche richiedono troppo tempo,  i titoli anticorpali possono rimanere a lungo tempo elevati e, a fronte di una elevata specificità la sensibilità può essere modesta. Per la sua importanza come agente zoonosico, negli ultimi anni l’attenzione dei ricercatori si è rivolta soprattutto a Toxoplasma gondii: per la diagnosi di Toxoplasmosi nell’uomo sono state allestite  reazioni  di  PCR  i  cui  risultati vanno sempre messi in correlazione con i dati  clinici, sierologici ed, eventualmente, immunoistochimici in quanto la positività potrebbe essere correlabile ad uno stato di premunizione per infezioni pregresse. In medicina veterinaria T. gondii, come causa di  aborto  nei  piccoli  ruminanti,  è  stato  studiato  tramite nested-PCR  e  reazioni  di  PCR  in  grado  di individuare  il  protozoo  nel  cervello,  nella  placenta  e  nei  cotiledoni  dei  feti  abortiti.  Con la PCR è possibile anche individuare T.  gondii in  campioni  biologici di cani e  gatti:  umore acqueo, liquido cerebrospinale, sangue. Anche la diagnosi di Neosporosi può essere conseguita mediante la PCR.

Inoltre, poiché T. gondii e Neospora caninum non sono ben distinguibili morfologicamente e vi può essere  cross -reattività  all’esame  sierologico,  la PCR che consente di ricercare  entrambi  i  protozoi contemporaneamente  distinguendoli.  La  diagnosi di  Babesiosi  e Theileriosi si consegue  con l’osservazione al microscopio ottico di strisci di sangue (Babesia ) o di biopsie linfonodali (Theileria ), colorati  con  il  metodo  di  Giemsa  e  MayGrunwald-Giemsa.

Tuttavia,  la  diagnosi  di  certezza  e l’identificazione  della  specie  parassitaria  responsabile  possono  presentare  notevoli  difficoltà;  ad esempio gli animali che superano la fase acuta divengono portatori asintomatici di un numero molto scarso di parassiti che non è possibile individuare con l’osservazione microscopica. L’attenzione della comunità scientifica si è rivolta soprattutto alla Babesiosi dei bovini (le specie più importanti sono B. bovis e B. bigemina) e degli equini (B. equi e B. caballi) e alla Theileriosi dei bovini (le specie più importanti sono T. annulata e T. parva).

Sono state messe a punto reazioni di multiplex-PC R in grado di individuare contemporaneamente B. bovis, B. bigemina e Anaplasma marginale   , diagnosi che può essere perfezionata dall’applicazione del  dot-blot.  Reazioni di PCR  sono utilizzabili per la diagnosi delle infezioni sostenute  da T. annulata, da  T.  parva  e  da  entrambe  le  specie.  E’ stata disegnata  una  sonda B.  bovis-specifica  in grado di individuare il  protozoo  nel  sangue intero con  sensibilità molto alta; sono state disegnate sonde specifiche per l’identificazione contemporanea di sei specie di The ileria mentre è stata messa a punto una RLB in grado di esaminare molti campioni per individuare contemporaneamente tutte le specie di Babesia e Theileria  dei bovini.  Per quanto riguarda la Babesiosi degli equini, in molti Paesi Europei,  il  test  ufficiale  è  la  FdC,  caratterizzata  però  da  bassa  sensibilità.

La  PCR  è  in  grado  di individuare i cavalli infetti che risultano negativi ai test sierologici. La diagnosi di Criptosporidiosi si  effettua  tramite  l’osservazione  (a  forte  ingrandimento)  al  microscopio  ottico  di  strisci  fecali colorati con il metodo di Machiavello, di Ziehl-Neelsen o di Giemsa ovvero con la sedimentazione, previa concentrazione con soluzione di Telemann. Sono utilizzabili anche l’ELISA e l’IF, che però non consentono l’identificazione di specie. Con l’osservazione diretta si può formulare diagnosi di certezza  solo  nei  casi  di  infezioni  acute,  in  cui  si  ritrovano  numerose  oocisti  o  sporocisti,  fino  a 500.000/gr. Anche l’ELISA e l’IF sono attendibili solo se effettuate con infezione acuta in atto. La PCR  presenta  sensibilità  molto  elevata  (fino  a –  8090  forme  cistiche/gr.),  permettendo  quindi  di individuare anche i soggetti eliminatori asintomatici. L’applicazione della PCR nella diagnosi delle infezioni  da Cryptosporidium   è  molto  importante  anche  in  medicina  umana  per  le  implicazioni  di questa patologia come zoonosi: sono state, infatti, messe a punto PCR in grado di differenziare gli stipiti  umani  e  animali  di Cryptosporidium  parvum    e Cryptosporidium   da Cyclospora,  che  sono protozoi  con  diversa  sensibilità  ai  farmaci.

La  diagnosi  di Giardiosi     si  può  conseguire  con l’osservazione diretta al microscopio di strisci di materiale fecale o di campioni arricchiti con 4 ZnSO, colorati con liquido di Lugol. A causa dell’eliminazione irregolare di cisti è però necessario effettuare la ricerca nelle feci per tre gg. consecutivi (infatti un solo esame può permettere di individuare solo il 50%  dei  campioni  positivi).  E’ stato inoltre dimostrato che l’IF e  l’ELISA,  test  spesso  utilizzati, possono dare risultati falsi negativi (bassa sensibilità) e falsi positivi (bassa specificità).

La PCR è in grado di individuare ed amplificare tratti di DNA Giardia – specifici, distinguendo anche ceppi patogeni  ed  apatogeni e cisti vitali e  non  vitali. La ricerca di cisti e trofozoiti di Entamoeba hystolitica  è possibile sia con l’osservazione al microscopio di strisci fecali colorati con – Fe ematossilina  sia  con  esami  colturali.  Per  la  diagnosi  possono  essere  utilizzate  anche  l’ELISA  e  la FdC.  La  PCR  è  in  grado  di  individuare E.  hystolitica distinguendo anche in questo caso ceppi patogeni da ceppi a-patogeni.

La  diagnosi di Coccidiosi aviare  si consegue con l’esame microscopico delle feci,  per  evidenziare le  oocisti o con l’esame del raschiato della  mucosa intestinale, per individuare gli schizonti. Per le differenze patogenetiche che caratterizzano le diverse specie di coccidi, é spesso necessario ottenere l’identificazione di specie e non sempre le differenze morfologiche (forma e dimensioni), sono ben individuabili.
E’ possibile utilizzare la RAPD,  dotata di elevata sensibilità e specificità, in grado di rilevare e differenziare otto specie di Eimeria dei polli.

 

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