Parassitologia Veterinaria

Le  reazioni  di  amplificazione  messe  a  punto  per  la  diagnosi  delle  malattie  parassitarie  utilizzano come bersaglio sequenze di DNA parassita-specifiche appartenenti a geni codificanti per proteine di superficie, antigeni somatici, prodotti enzimatici ovvero sequenze appartenenti al rDNA.

A seconda del template, possono essere usati primers altamente conservati (come nel caso del rDNA) oppure primers disegnati su sequenze  codificanti  specie -specifiche.  In campo medico umano e veterinario la PCR viene impiegata per lo studio di alterazioni genetiche e per la diagnosi molecolare utilizzando come template:
– sequenze alterate che possono indurre malattie neoplastiche e/o  malattie genetiche;
– sequenze non patologiche che possono essere impiegate per studi di genetica delle popolazioni e nell’ambito della medicina legale.

Nel campo della parassitologia veterinaria, la PCR viene utilizzata nell’identificazione dei parassiti, nell’epidemiologia e nella diagnosi delle malattie, nello studio della farmacoresistenza e dei geni che codificano per proteine impiegate nei vaccini e negli studi di sistematica. L’applicazione  della  PCR  in  parassitologia  non  è  però  scevra  da  problemi  ed  inconvenienti; nonostante il template sia ottenibile da uova, larve ed adulti, non è sempre facile ricavare DNA puro ed  in  quantità  sufficiente. Questo  è  dovuto  alla  spessa  cuticola  esterna  dei  parassiti  ed  alla precipitazione di   flocculi   polisaccaridici durante l’estrazione del  DNA,  in grado di inibire l’amplificazione enzimatica.

La scelta del template dipende dallo scopo che si vuol perseguire. Ad esempio, gli introni e le regioni non codificanti sono, rispetto alle regioni codificanti, più soggette nel tempo a subire mutazioni; viceversa, geni associati a particolari funzioni sono scarsamente soggetti a subire  mutazioni  spontanee,  in  quanto  sovente  correlati  alla  sopravvivenza  dell’organismo.  Se l’utilizzo della PCR  è mirato all’identificazione  di  specie,  il  template  deve  presentare  variazioni intraspecifiche significativamente inferiori rispetto alle variazioni interspecifiche.

Se il template deve avere  markers  per  l’identificazione  dei  diversi  ceppi,  deve  esserci  un  significativo  livello  di variazioni  di   sequenze  fra  le  specie  oggetto  di  studio.  Il  DNA  ribosomiale  (rDNA)  è  un  target impiegato  per  l’identificazione  di  specie  e/o  di  markers  ceppo  specifici:  le  sequenze  di  rDNA presentano omogeneità elevata soprattutto intraspecifica piuttosto che interspecifica.

Una volta individuato il template, se non sono disponibili dati in bibliografia, è necessario disegnare i primers  specifici,  in  senso  5’3’. I  primers  oligonucleotidici  sono disegnati  su  regioni  di  DNA specie  –  specifiche e vengono  utilizzati  a  scopi  diagnostici.  Alcune  sequenze  dell’rDNA  sono utilizzabili  a  scopi  identificativi  e  diagnostici.  Per  la  caratterizzazione  dell’rDNA  e  del  mtDNA,  è possibile  utilizzare  primers  altamente  conservati,  specifici  per  le  sequenze  di  un  certo  numero  di parassiti o per intere popolazioni parassitarie.

I più importanti tipi di PCR sono di seguito elencati: La nested  – PCR  è basata su due reazioni di amplificazione consecutive: la seconda amplificazione è effettuata  mediante  una  coppia  di  primers  più  interni  rispetto  ai  primers  della  prima  reazione.  La seconda coppia produce così un amplificato (di dimensioni inferiori) d’alto valore diagnostico, ma solo se il risultato della prima amplificazione è specifico.

La multiplex  – PCR  prevede  invece  l’utilizzo  simultaneo  di due  o  più  coppie  di  primers  che amplificano  due  o  più  tratti  di  DNA  bersaglio  appartenenti  allo  stesso  parassita  od  a  parassiti differenti.  La  PCR  può  essere  usata  come  metodica  a  se  stante  oppure  può  essere associata a tecniche  più complesse. Nella PCR – RFLP (Restriction  Fragment  Length  Polymorphism) l’amplificazione mediante PCR è seguita da digestione con le endonucleasi (enzimi di restrizione, es. Hinf, Hind III, Hinc II, EcoRI , Nsp I) in grado di tagliare il DNA in siti specifici detti “siti di restrizione” , dando origine  a segmenti  di DNA di  lunghezza caratteristiche  che   fungono  da  markers  genetici  specie- specifici.  Il taglio degli enzimi di restrizione può essere di 2 tipi e può generare estremità sfalsate “sti cky ends” o piatte “blunt ends”:

La RFLP di amplificati ottenuti con la PCR permette l’identificazione di parassiti (particolarmente impiegata per gli elminti) tassonomicamente vicini e simili morfologicamente, in quanto consente di rilevare  anche  lievi  variazioni (polimorfismi)  nel  tratto  di  DNA  amplificato.  L’ AFLP   (Amplified Fragment  Lenght  Polymorphism) è  stata  applicata  per identificare  variazione  genetiche di  piante, funghi, animali e batteri e per la diagnosi di patologie.  Il metodo si basa sull’uso di enzimi di restrizione per la digestione del DNA genomico, seguito dal legame di adattatori  complementari  al  doppio  filamento  all estremità  3’ -5’ dei frammenti di restrizione.

I diversi frammenti di restrizione  vengono poi amplificati usando due  primers  complementari  agli adattatori  e  poi  sono  visualizzati  su  gel  di  poliacrilammide. L’AFLP  ha  la  capacità  di  individuare simultaneamente vari   polimorfismi in  differenti   regioni   genomiche,  ha un’alta   sensibilità  e riproducibilità, ha la capacità di amplificare tra 0 e 100 frammenti  alla  volta  e  non  necessita di conoscere  la sequenza  da  esaminare dato  che  vengono utilizzati  enzimi  di  restrizione  “universali”, cioè in grado di tagliare qualsiasi DNA genomico. Una limitazione potrebbe essere dovuta al fatto che viene realizzata in tempi piuttosto lunghi o per l’alto livello di variazioni individuate, quindi può essere di difficile interpretazione.

La RAPD (Random  Amplified  Polymorphic  DNA ), ovvero  l’amplificazione  random  di  sequenze anonime di DNA, utilizza brevi sequenze   oligonucleotidiche  come innesco per la Taq polimerasi. La reazione viene effettuata in condizioni di bassa stringenza, cioè ad una temperatura di appaiamento del  primer  molto  bassa.  In  tal  modo  i  primers  possono  appaiarsi  anche  a  sequenze  di  DNA  non esattamente complementari alla propria e possono perciò innescare la reazione di polimerizzazione da  parte  della  Taq  polimerasi  in  più  punti  del  genoma  bersaglio.  In  questo  modo  alla  fine  della reazione  di  amplificazione  si  otterrà  non  un  singolo  frammento  amplificato,  ma  una  serie  di frammenti il cui numero e la cui lunghezza varierà da ceppo a ceppo.

La RAPD è semplice e veloce, ma non offre riproducibilità pari a quella della PCR standard. Il pattern di bande prodotte può  essere  influenzato da diversi fattori quali, la qualità del DNA, la specificità dei primers, la concentrazione del  template, la co -migrazione   in  gel  di  agarosio di  frammenti  non-omologhi  (cioè  della  stessa lunghezza ma di sequenza diversa) e l’uso di differenti termociclizzatori determinando, quindi, una scarsa riproducibilità. Nonostante queste limitazioni, diversi studi hanno mostrato che la RAPD può essere utilizzata per l’identificazione e la differenziazione di specie e ceppi di un range di parassiti, includendo protozoi e elminti. Nel corso degli anni tramite la RAPD si è ottenuta la definizione di markers specifici per una ampia gamma di ceppi e specie di parassiti protozoi e metazoi.

La Reverse Line Blot (RLB) è una metodica che si basa sull’appaiamento di sonde specifiche con  dei  prodotti  di  PCR.  Il  metodo consente, in un  singolo  saggio, di  ibridare i campioni  con diverse sonde   oligonucleotidiche  senza l’impiego di   sostanze  radioattive.  Le   sonde vengono   legate   covalentemente  in  linee  parallele su un  miniblotter  (supporto).  Dopo aver  legato le  sonde,  la membrana  viene  ruotata  di  90°. I  canali  sul  miniblotter vengono riempiti con  i  prodotti  di  PCR marcati   con   biotina.   L’ibridazione   viene   visualizzata   usando   una   perossidasi   marcata   con streptavidina,  che  interagisce  con  la  biotina  del  prodotto  di  PCR, e  poi  si  visualizza mediante chemioluminescenza. Il miniblotter  può essere ripulito e riusato diverse volte (>10).

PFGE – Pulsed Field Gel le Ectrophoresis: La PFGE raggruppa tutte quelle metodiche di separazione di frammenti del DNA che sfruttano   un campo  elettrico  la  cui  direzione,  rispetto  alla  matrice  solida  in  cui  avviene  la  migrazione,  viene variata periodicamente. L’elettroforesi in gel di agarosio convenzionale impiega un campo elettrico statico e riesce a separare frammenti di DNA di grandezza massima –  di 50  20kb. La PFGE permette di separare frammenti fino a 10Mb sfruttando la lentezza dei grossi frammenti nel riorientarsi ad ogni variazione del campo elettrico, lentezza che è proporzionale alla dimensione  del frammento.

Sonde Molecolari: Le Probes  o  sonde  molecolari,  sono  singoli  filamenti  di  DNA  marcati  radioattivamente o  con sostanze cromogene, in grado di appaiarsi soltanto con tratti di DNA complementari. La marcatura può essere fatta all’estremità o all’interno della sequenza sonda.
Se la sonda molecolare è marcata con una sostanza radioattiva, il DNA viene visualizzato  mediante autoradiografia, se invece è marcata con una sostanza cromogena il DNA si visualizza mediante una reazione colorimetrica.  In diagnostica, le sequenze target a cui si appaiano le sonde sono sequenze patogeno – specifiche, ed è importante che non siano  variabili in senso intraspecifico per evitare il rischio di risultati falsi negativi.
In parassitologia veterinaria, le sonde sono utilizzabili per la diagnosi di malattie che si presentano con sintomatologia spesso simile, come ad esempio la Babesiosi, la Theileriosi e l’Anaplasmosi dei bovini.

DB – Dot Blot: Il Dot  Blot è una metodica  in cui le sonde molecolari sono messe a contatto diretto con il campione biologico  i n  esame.  Il Dot  Blot   può  essere  utilizzato  sia  su  campioni  di  DNA  sia  su  campioni  di RNA.  In  entrambi  i  casi,  gli  acidi  nucleici  del  campione  di  partenza  vengono  filtrati  sottovuoto direttamente   sulla   membrana,   la quale viene  esposta alla sonda   marcata   radioattivamente.

Un’eventuale ibridazione viene quindi determinata tramite autoradiografia. Il  dot blot permette una maggiore velocità  d’esecuzione  e  la  contemporanea  analisi  di  un  maggior  numero  di  campioni. Questa è una metodica soprattutto quantitativa che permette di determinare, per esempio, il numero di copie di un certo gene presenti in un determinato genoma o la quantità di un certo RNA cellulare.

SSCP – Single Strand Conformation Polymorphism: La SSCP sfrutta la  separazione  elettroforetica  della  singola  elica  di DNA  che, in  assenza  della complementare, è altamente instabile e d assume particolari  conformazioni tridimensionali  a seconda della composizione in basi (basi diverse conferiscono  una diversa struttura secondaria e quindi una differente mobilità  elettroforetica ).  In  questo  modo  è  possibile  discriminare  filamenti  di  DNA  che differiscono  anche  per  una  sola  base. Per  una  risoluzione  ottimale si  processano  frammenti  lunghi 150 – 300 bp. Nella doppia elica, invece, la mobilità dipende dalla lunghezza del frammento e non dalla composizione in basi.

 

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