Dna Plasmidico
Crescita della coltura batterica, Preparare il liquido LB medium. Luria-Bertani Medium è un ricco brodo per la crescita di E. coli costituito da :
• Triptone 10g,
• Estratto di lievito 5g,
• NaCl 10 g.
Addizionare a 950 ml di H2O deionizzata. Al brodo liquido si aggiunge per ogni litro, 15 g di Agar per solidificarlo e l’antibiotico selezionato(come marker di selezione). Aggiustare il pH a 7.0 con NaOH 5N. Sterilizzare in autoclave.
Screening dei cloni ricombinanti:
• Far crescere le cellule batteriche su un terreno contenente un antibiotico(ad es. ampicillina);cresceranno colonie che hanno il plasmide inserito,
• Il pBR322 è un vettore molto utilizzato contenente i geni per la resistenza ad Amp e Tet.
Colony hybridation:
• Si può procedere mediante l’utilizzo di sonde radioattive (replica plating).
• Se si conosce la sequenza del gene clonato, è possibile individuare le colonie contenenti l’inserto, mediante PCR.
Raccolta e lisi della cellula batterica e purificazione blanda del Dna plasmidico mediante trattamento enzimatico. Raccolta e lisi dei batteri:
La lisi può avvenire:
• Per bollitura.
• Per trattamento con sostanze alcaline.
Lisi mediante sostanze alcaline:
EDTA: chelante per gli ioni bivalenti Ca++ e Mg++ presenti nel doppio strato lipidico, agisce indebolendo la parete cellulare.
NSS: miscela alcalina che lisa le cellule batteriche rilasciando il contenuto cellulare,
NSS: 0,2 N di NaOH,
0,5 SDS,
20% saccarosio,
SDS: sodio duodecilsolfato dissolve i componenti lipidici e le proteine della parete cellulare.
NaOH: denatura il Dna cromosomico e plasmidico in filamenti singoli. Il Dna cromosomico si separa completamente, i cerchi interi di Dna plasmidico a singolo filamento restano associati come anelli concatenati.
KCl : determina la precipitazione del SDS associato con proteine e lipidi dalla sospensione cellulare.
PH alcalino ————–→ PH neutro : rinaturazione del Dna, I filamenti di Dna cromosomico rinaturano parzialmente e restano intrappolati nel precipitato.
Il Dna plasmidico si rinatura completamente, Purificazione blanda:
• Con estrazioni fenoliche.
• Enzimatica (mediante Rna ase ).
Purificazione spinta:
• Centrifugazione su gradiente di CsCl.
• Colonna di affinità (colonna di resina per purificare il materiale ).
Analisi qualitativa e quantitativa:
• Spettrofotometrica (quantitativa).
• Elettroforesi su gel (qualitativa).
Lisi della cellula batterica e purificazione blanda del Dna plasmidico mediante trattamento enzimatico.
Steeps:
• Prelevare da una piastra ,con uno stuzzicadenti sterile, una colonia.
• In una cuvetta eppendorf mettere 50 μl di EDTA 10 mM (pH 8.0) e inserirvi la colonia prelevata.
• Miscelare l’EDTA,essendo un chelante di ioni Ca++ e Mg++ presenti nel doppio strato lipidico della membrana cellulare, agisce destabilizzandola.
• Aggiungere 50 μl di NSS alla cuvetta eppendorf. L’ NSS è una miscela alcalina che lisa le cellule batteriche , favorendo la fuoriuscita del materiale cellulare.
• Vortexare per 30 secondi.
• Mettere la soluzione così preparata in bagno caldo a 70° gradi per 5 minuti.
• Lasciare raffreddare portando la soluzione a temperatura ambiente.
• Aggiungere 1.5 μl di KCl 4M nella cuvetta. Il KCl determina la precipitazione del SDS associato con proteine e lipidi dalla sospensione cellulare
• Vortexare per 30 secondi.
• Incubare la cuvetta per 5 minuti nel ghiaccio.
• Centrifugare a 12.000 giri per 3 minuti. Lo scopo della centrifugazione è la separazione del Dna cromosomale dal Dna plasmidico.
• Separare il surnatante dal pelletts e trasferirlo in un’altra cuvetta. Aggiungere 1 μl di Rna ase (degradazione enzimatica).
• Incubare a 37° gradi per 30 minuti.
