Sequenziamento

Il sequenziamento  del  DNA consiste  in  una  reazione  di  PCR  modificata  in  cui  viene  inserito  un reagente  in  più,  cioè  una  miscela  di  4  terminatori  marcati  con  quattro  diversi  fluorocromi  e  il  cui template è rappresentato dal prodotto di PCR purificato.

Un terminatore è un – dideossi -nucleotide (ddNTP), cioè un nucleotide con un atomo di ossigeno in meno in posizione 3’. La sintesi del nuovo filamento di DNA si blocca quando viene inserito un ddNTP.  Al  termine  della  reazione  si  ottiene  una  miscela  di  frammenti  di  DNA  di  lunghezze  diverse  che differiscono per un singolo nucleotide e che terminano con un ddNTP marcato.

All’interno del sequenziatore:
• i frammenti della miscela vengono separati e ordinati secondo la loro lunghezza;
• colpiti da un raggio di luce laser che eccita i fluorocromi coniugati ai terminatori;
• viene rilevata una emissione di fluorescenza di colore diverso per ognuno dei quattro terminatori;
• un software ricostruisce automaticamente   la sequenza  del frammento iniziale di DNA abbinando a ciascuna emissione luminosa il corrispondente ddNTP.

Il  risultato  (ferogramma)  può  essere  visualizzato  e  analizzato  con  appositi  software  disponibili  in rete. Ad  ogni  base  corrisponde  un  picco,  la  cui  altezza  è  direttamente  proporzionale  all’intensità  della fluorescenza  emessa  (il  basso “rumore  di  fondo”,  cioè  i  picchi  presenti  più  in,   basso  è  indice  di purezza del campione di partenza).
Il sequenziamento rappresenta un ulteriore strumento  per l’identificazione dei parassiti e per gli studi di  sistematica.  In  letteratura  sono  riportati  dati  derivanti  dal  sequenziamento  di  amplificati  relativi alla distinzione di specie/ceppo ed alla definizione di markers specifici, all’identificazione di specie criptiche, a ricostruzioni filogenetiche.

Alcuni Software utilizzati nell’analisi di sequenza  sono:
–  BioEdit,
–  M EGA,
–  DAMBE.

Sequenziamento con Marcatori Fluorescenti: Coniugando a ciascun ddNTP un diverso marcatore fluorescente, è possibile effettuare le quattro reazioni di sequenziamento in un unico tubo da saggio e caricare il tutto in un solo pozzetto di gel.

In questo caso non si fa un’autoradiografia ma si sottopone il gel ad un raggio laser che eccita i fluorofori, i quali riemettono radiazione elettromagnetica della lunghezza d’onda corrispondente di ogni fluoroforo. Le emissioni fluorescenti vengono captate da un rilevatore e le informazioni vengono integrate e trasformate in picchi di colore diverso, con aree proporzionali all’intensità di emissione.

Potrebbero interessarti anche...