Trasferimento Acidi Nucleici

È il trasferimento e immobilizzazione di un campione di acidi nucleici su un supporto solido (in genere nitrocellulosa o nylon). Southern blotting: Il gel di agarosio contenente il DNA da trasferire viene posto su un ponte di carta da filtro, le cui estremità pescano all’interno di un recipiente contenente il tampone di trasferimento. La membrana viene posta in contatto con il gel e coperta da una pila di tovaglioli di carta assorbente, che, per capillarità, richiamerà il tampone.

Le molecole di DNA vengono trasportate dal flusso di tampone attraverso il gel verso i tovaglioli di carta, rimanendo intrappolate sulla membrana che non è permeabile al DNA. Condizione essenziale è il pre-trattamento del gel: il DNA su gel viene trattato con una soluzione di HCl 0.25M e poi con una soluzione alcalina (depurinazione e denaturazione), il gel viene poi posto in una soluzione neutralizzante per riportare il pH a valori simili a quelli del tampone di trasferimento.
Dopo il trasferimento gli acidi nucleici devono essere fissati sulla membrana: in genere si utilizzano i raggi UV (inducono la formazione di legami covalenti tra le Timine del DNA e i gruppi amminici carichi presenti sulla membrana) o si pone la membrana in stufa a 80°C.

Si procede, poi, con l’immersione della membrana in una soluzione contenente RNA o DNA a singolo filamento o oligonucleotidi marcati la cui sequenza sia complementare a quella del frammento che si vuole identificare sulla membrana. le condizioni di ibridazione vengono scelte in modo da massimizzare la quantità di sonda legata al bersaglio e ridurre il legame non specifico.
La membrana viene quindi lavata per eliminare l’eccesso di sonda non legato. L’avvenuto legame viene evidenziato mediante autoradiografia (ovvero mettendo la membrana in contatto con una lastra da raggi X). Differenti condizioni di ibridazione producono appaiamenti non corretti.

Se si desidera ottenere solo l’appaiamento alle sequenze target di DNA, la reazione di ibridazione viene condotta appena qualche grado al di sotto della temperatura di fusione della doppia elica (melting temperature). Quando la sonda di DNA viene usata per trovare DNA che sono correlate, ma non identiche, alla sequenza, l’ibridazione viene condotta a temperature più basse. Ciò consente l’appaiamento imperfetto e la formazione della doppia elica. Solo le condizioni di ibridazione a bassa temperatura possono essere usate per cercare geni (C e E nell’esempio) che sono simili ma non identici al gene A.

In genere l’ibridazione viene effettuata in condizioni di bassa stringenza, mentre i lavaggi hanno una stringenza via via più elevata (temperatura maggiore o salinità più bassa). Northern blotting: Si segue all’incirca la procedura del Southern, ma in questo caso si prepara un gel di agarosio denaturante (formaldeide, MOPS), si carica RNA denaturato, dopo la corsa lo si trasferisce su nylon, immobilizzazione-ibridazione con la sonda marcata-rilevazione.

 

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