il Dna plasmidico può essere separato ed analizzato tramite diverse tecniche che riporto di seguito. una di queste è una tecnica di separazione basata sul movimento di molecole cariche in un campo elettrico. Sotto l’azione di un campo elettrico particelle cariche migrano verso l’elettrodo di segno opposto. Forze che concorrono alla migrazione: forza di spinta e forza frenante.
Forza di spinta:
F1 = q x E
q = carica elettrica di proteine
E = campo elettrico applicato che equivale a v/d
v = differenza di potenziale tra gli elettrodi
d = distanza tra gli elettrodi
Forza frenante:
F2 = f x v
f = coefficiente frizionale equivalente a 6πr
r = raggio
n = viscosità del mezzo
v = velocità
in condizioni di equilibrio tra F1 e F2 ossia:
q x E = f x v
viene raggiunta una velocità di migrazione costante :
V = q E/ 6π r
Quando il campo E è uguale a 1, la velocità di migrazione prende il nome di mobilità elettroforetica e dipende da:
- carica netta : le molecole più cariche migrano più velocemente.
• dimensioni : le molecole più piccole migrano più velocemente.
• forma : diversa mobilità di Dna lineare e circolare.
• forza del campo elettrico: la mobilità aumenta all’aumentare del voltaggio applicato.
• viscosità del mezzo:la mobilità diminuisce all’aumentare della viscosità.
L’elettroforesi viene solitamente condotta su un supporto inerte ed omogeneo, preparato in un opportuno tampone e con il quale viene saturato in modo da consentire la conduzione della corrente. I supporti solidi normalmente utilizzati sono carta, acetato di cellulosa, agarosio, poliacrilammide.
Elettroforesi zonale,
Su carta: proteine, aminoacidi,
Nel caso di separazioni di sostanze ad alto peso molecolare, come le proteine e gli acidi nucleici, l’uso di gel come supporto è più indicato.
Elettroforesi zonale tipologie:
Su gel orizzontale.
Su gel verticale.
Gel d’agarosio: L’agarosio è un polisaccaride lineare neutro estratto dalle alghe rosse e consiste di unità ripetute di galattosio e agarobiosio legati in maniera crociata da legami idrogeno tra le catene polimeriche.
Tampone: I tamponi forniscono gli ioni per la corrente elettrica e mantengono costante lo stato di ionizzazione delle molecole da separare, la cui carica cambia con il PH. Il tampone in cui è sciolto l’agarosio è il Tris-Borate-EDTA (TBE) a concentrazione 1x o 0.5x, in alcuni casi è il Tris Acido Acetico EDTA. La polvere di agarosio si mescola con il tampone di TBE. Il gel consiste di una matrice porosa che deriva dalla formazione di legami idrogeno crociati tra le catene polimeriche dell’agarosio. All’aumentare della concentrazione di agarosio diminuiscono le dimensioni dei pori del gel.
Elettroforesi di acidi nucleici, La mobilità degli acidi nucleici in un gel d’agarosio dipende da:
- Concentrazione d’agarosio.
• Dimensioni dell’acido nucleico.
• Forma del Dna.
Concentrazione d’agarosio: Viene stabilita sulle basi delle dimensioni del frammento di Dna. Più piccole sono le molecole di Dna maggiore sarà la concentrazione di agarosio (per avere pori piccoli), e viceversa,più grandi sono le molecole di Dna e minore sarà la concentrazione di agarosio.
Per frammenti compresi tra:
- 0.1 kb – 0.4 kb si utilizza una concentrazione di agarosio pari a 1.5% – 2%.
• 0.3 kb – 3 kb si utilizza una concentrazione di agarosio pari a 0.7% – 1%.
• > 5 kb si utilizza una concentrazione di agarosio pari allo 0.3% .
Dimensioni delle molecole di Dna: Molecole di Dna scorrono attraverso il gel ad una velocità inversamente proporzionale al loro peso molecolare,ossia più sono grandi più lentamente si muovono,più sono piccole più velocemente si muovono. La mobilità elettroforetica diminuisce all’aumentare del peso molecolare.
La mobilità elettroforetica del Dna di dimensioni simili ma di forma diversa,mostra differenti caratteristiche di migrazione. Le molecole di Dna circolare e superavvolte presentano una mobilità maggiore,sopratutto le superavvolte.
Il Dna plasmidico può esistere in tre principali conformazioni:
- Superavvolta.
- Cerchio rilassato o interrotto.
- Lineare.
