Le reazioni di amplificazione messe a punto per la diagnosi delle malattie parassitarie utilizzano come bersaglio sequenze di DNA parassita-specifiche appartenenti a geni codificanti per proteine di superficie, antigeni somatici, prodotti enzimatici ovvero sequenze appartenenti al rDNA.
A seconda del template, possono essere usati primers altamente conservati (come nel caso del rDNA) oppure primers disegnati su sequenze codificanti specie -specifiche. In campo medico umano e veterinario la PCR viene impiegata per lo studio di alterazioni genetiche e per la diagnosi molecolare utilizzando come template:
– sequenze alterate che possono indurre malattie neoplastiche e/o malattie genetiche;
– sequenze non patologiche che possono essere impiegate per studi di genetica delle popolazioni e nell’ambito della medicina legale.
Nel campo della parassitologia veterinaria, la PCR viene utilizzata nell’identificazione dei parassiti, nell’epidemiologia e nella diagnosi delle malattie, nello studio della farmacoresistenza e dei geni che codificano per proteine impiegate nei vaccini e negli studi di sistematica. L’applicazione della PCR in parassitologia non è però scevra da problemi ed inconvenienti; nonostante il template sia ottenibile da uova, larve ed adulti, non è sempre facile ricavare DNA puro ed in quantità sufficiente. Questo è dovuto alla spessa cuticola esterna dei parassiti ed alla precipitazione di flocculi polisaccaridici durante l’estrazione del DNA, in grado di inibire l’amplificazione enzimatica.
La scelta del template dipende dallo scopo che si vuol perseguire. Ad esempio, gli introni e le regioni non codificanti sono, rispetto alle regioni codificanti, più soggette nel tempo a subire mutazioni; viceversa, geni associati a particolari funzioni sono scarsamente soggetti a subire mutazioni spontanee, in quanto sovente correlati alla sopravvivenza dell’organismo. Se l’utilizzo della PCR è mirato all’identificazione di specie, il template deve presentare variazioni intraspecifiche significativamente inferiori rispetto alle variazioni interspecifiche.
Se il template deve avere markers per l’identificazione dei diversi ceppi, deve esserci un significativo livello di variazioni di sequenze fra le specie oggetto di studio. Il DNA ribosomiale (rDNA) è un target impiegato per l’identificazione di specie e/o di markers ceppo specifici: le sequenze di rDNA presentano omogeneità elevata soprattutto intraspecifica piuttosto che interspecifica.
Una volta individuato il template, se non sono disponibili dati in bibliografia, è necessario disegnare i primers specifici, in senso 5’3’. I primers oligonucleotidici sono disegnati su regioni di DNA specie – specifiche e vengono utilizzati a scopi diagnostici. Alcune sequenze dell’rDNA sono utilizzabili a scopi identificativi e diagnostici. Per la caratterizzazione dell’rDNA e del mtDNA, è possibile utilizzare primers altamente conservati, specifici per le sequenze di un certo numero di parassiti o per intere popolazioni parassitarie.
I più importanti tipi di PCR sono di seguito elencati: La nested – PCR è basata su due reazioni di amplificazione consecutive: la seconda amplificazione è effettuata mediante una coppia di primers più interni rispetto ai primers della prima reazione. La seconda coppia produce così un amplificato (di dimensioni inferiori) d’alto valore diagnostico, ma solo se il risultato della prima amplificazione è specifico.
La multiplex – PCR prevede invece l’utilizzo simultaneo di due o più coppie di primers che amplificano due o più tratti di DNA bersaglio appartenenti allo stesso parassita od a parassiti differenti. La PCR può essere usata come metodica a se stante oppure può essere associata a tecniche più complesse. Nella PCR – RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) l’amplificazione mediante PCR è seguita da digestione con le endonucleasi (enzimi di restrizione, es. Hinf, Hind III, Hinc II, EcoRI , Nsp I) in grado di tagliare il DNA in siti specifici detti “siti di restrizione” , dando origine a segmenti di DNA di lunghezza caratteristiche che fungono da markers genetici specie- specifici. Il taglio degli enzimi di restrizione può essere di 2 tipi e può generare estremità sfalsate “sti cky ends” o piatte “blunt ends”:
La RFLP di amplificati ottenuti con la PCR permette l’identificazione di parassiti (particolarmente impiegata per gli elminti) tassonomicamente vicini e simili morfologicamente, in quanto consente di rilevare anche lievi variazioni (polimorfismi) nel tratto di DNA amplificato. L’ AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphism) è stata applicata per identificare variazione genetiche di piante, funghi, animali e batteri e per la diagnosi di patologie. Il metodo si basa sull’uso di enzimi di restrizione per la digestione del DNA genomico, seguito dal legame di adattatori complementari al doppio filamento all estremità 3’ -5’ dei frammenti di restrizione.
I diversi frammenti di restrizione vengono poi amplificati usando due primers complementari agli adattatori e poi sono visualizzati su gel di poliacrilammide. L’AFLP ha la capacità di individuare simultaneamente vari polimorfismi in differenti regioni genomiche, ha un’alta sensibilità e riproducibilità, ha la capacità di amplificare tra 0 e 100 frammenti alla volta e non necessita di conoscere la sequenza da esaminare dato che vengono utilizzati enzimi di restrizione “universali”, cioè in grado di tagliare qualsiasi DNA genomico. Una limitazione potrebbe essere dovuta al fatto che viene realizzata in tempi piuttosto lunghi o per l’alto livello di variazioni individuate, quindi può essere di difficile interpretazione.
La RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA ), ovvero l’amplificazione random di sequenze anonime di DNA, utilizza brevi sequenze oligonucleotidiche come innesco per la Taq polimerasi. La reazione viene effettuata in condizioni di bassa stringenza, cioè ad una temperatura di appaiamento del primer molto bassa. In tal modo i primers possono appaiarsi anche a sequenze di DNA non esattamente complementari alla propria e possono perciò innescare la reazione di polimerizzazione da parte della Taq polimerasi in più punti del genoma bersaglio. In questo modo alla fine della reazione di amplificazione si otterrà non un singolo frammento amplificato, ma una serie di frammenti il cui numero e la cui lunghezza varierà da ceppo a ceppo.
La RAPD è semplice e veloce, ma non offre riproducibilità pari a quella della PCR standard. Il pattern di bande prodotte può essere influenzato da diversi fattori quali, la qualità del DNA, la specificità dei primers, la concentrazione del template, la co -migrazione in gel di agarosio di frammenti non-omologhi (cioè della stessa lunghezza ma di sequenza diversa) e l’uso di differenti termociclizzatori determinando, quindi, una scarsa riproducibilità. Nonostante queste limitazioni, diversi studi hanno mostrato che la RAPD può essere utilizzata per l’identificazione e la differenziazione di specie e ceppi di un range di parassiti, includendo protozoi e elminti. Nel corso degli anni tramite la RAPD si è ottenuta la definizione di markers specifici per una ampia gamma di ceppi e specie di parassiti protozoi e metazoi.
La Reverse Line Blot (RLB) è una metodica che si basa sull’appaiamento di sonde specifiche con dei prodotti di PCR. Il metodo consente, in un singolo saggio, di ibridare i campioni con diverse sonde oligonucleotidiche senza l’impiego di sostanze radioattive. Le sonde vengono legate covalentemente in linee parallele su un miniblotter (supporto). Dopo aver legato le sonde, la membrana viene ruotata di 90°. I canali sul miniblotter vengono riempiti con i prodotti di PCR marcati con biotina. L’ibridazione viene visualizzata usando una perossidasi marcata con streptavidina, che interagisce con la biotina del prodotto di PCR, e poi si visualizza mediante chemioluminescenza. Il miniblotter può essere ripulito e riusato diverse volte (>10).
PFGE – Pulsed Field Gel le Ectrophoresis: La PFGE raggruppa tutte quelle metodiche di separazione di frammenti del DNA che sfruttano un campo elettrico la cui direzione, rispetto alla matrice solida in cui avviene la migrazione, viene variata periodicamente. L’elettroforesi in gel di agarosio convenzionale impiega un campo elettrico statico e riesce a separare frammenti di DNA di grandezza massima – di 50 20kb. La PFGE permette di separare frammenti fino a 10Mb sfruttando la lentezza dei grossi frammenti nel riorientarsi ad ogni variazione del campo elettrico, lentezza che è proporzionale alla dimensione del frammento.
Sonde Molecolari: Le Probes o sonde molecolari, sono singoli filamenti di DNA marcati radioattivamente o con sostanze cromogene, in grado di appaiarsi soltanto con tratti di DNA complementari. La marcatura può essere fatta all’estremità o all’interno della sequenza sonda.
Se la sonda molecolare è marcata con una sostanza radioattiva, il DNA viene visualizzato mediante autoradiografia, se invece è marcata con una sostanza cromogena il DNA si visualizza mediante una reazione colorimetrica. In diagnostica, le sequenze target a cui si appaiano le sonde sono sequenze patogeno – specifiche, ed è importante che non siano variabili in senso intraspecifico per evitare il rischio di risultati falsi negativi.
In parassitologia veterinaria, le sonde sono utilizzabili per la diagnosi di malattie che si presentano con sintomatologia spesso simile, come ad esempio la Babesiosi, la Theileriosi e l’Anaplasmosi dei bovini.
DB – Dot Blot: Il Dot Blot è una metodica in cui le sonde molecolari sono messe a contatto diretto con il campione biologico i n esame. Il Dot Blot può essere utilizzato sia su campioni di DNA sia su campioni di RNA. In entrambi i casi, gli acidi nucleici del campione di partenza vengono filtrati sottovuoto direttamente sulla membrana, la quale viene esposta alla sonda marcata radioattivamente.
Un’eventuale ibridazione viene quindi determinata tramite autoradiografia. Il dot blot permette una maggiore velocità d’esecuzione e la contemporanea analisi di un maggior numero di campioni. Questa è una metodica soprattutto quantitativa che permette di determinare, per esempio, il numero di copie di un certo gene presenti in un determinato genoma o la quantità di un certo RNA cellulare.
SSCP – Single Strand Conformation Polymorphism: La SSCP sfrutta la separazione elettroforetica della singola elica di DNA che, in assenza della complementare, è altamente instabile e d assume particolari conformazioni tridimensionali a seconda della composizione in basi (basi diverse conferiscono una diversa struttura secondaria e quindi una differente mobilità elettroforetica ). In questo modo è possibile discriminare filamenti di DNA che differiscono anche per una sola base. Per una risoluzione ottimale si processano frammenti lunghi 150 – 300 bp. Nella doppia elica, invece, la mobilità dipende dalla lunghezza del frammento e non dalla composizione in basi.
