La sigla sta per "amplification fragment length polymorphism" quindi amplificazione di frammenti polimorfici ottenuti con la restrizione.
E' una combinazione tra l'analisi di restrizione e la PCR.
Quindi prima restrizione del DNA genomico del microrganismo da tipizzare con due tipi di enzimi di restrizion e poi un'aggiunta di molecole nucleotidiche chiamate adattatori che sono complementari ai siti di taglio per gli enzimi che ho utilizzato quindi siccome due enzimi di restrizione ci sono due adattatori.
La sigla sta per "amplification fragment length polymorphism" quindi amplificazione di frammenti polimorfici ottenuti con la restrizione.
E' una combinazione tra l'analisi di restrizione e la PCR.
Quindi prima restrizione del DNA genomico del microrganismo da tipizzare con due tipi di enzimi di restrizion e poi un'aggiunta di molecole nucleotidiche chiamate adattatori che sono complementari ai siti di taglio per gli enzimi che ho utilizzato quindi siccome due enzimi di restrizione ci sono due adattatori.
Questi adattatori si ligheranno ai miei frammenti digeriti (in modo da ridurre il numero di frammenti da correre) ottenendo un pezzo di DNA più un adattatore legato dopodichè faccio una PCR che prevede l'impiego di primer la cui sequenza è complementare agli adattatori inoltre c'è:
• un primo ciclo di PCR chiamato preselettivo
• un secondo ciclo di PCR chiamato selettivo che avrà primer marcati in qualche modo per visualizzare l'avvenuta reazione
Poi finalmente corro questi frammenti con un sequenziatore o un elettroforesi su gel di poliacrilammide perchè risoluzione più alta.
I due enzimi di restrizione sono:
• MseI: che taglia più frequentemente
• EcoRI: taglia meno frequentemente
Le molecole adattatrici:
• Per MseI: riconosce la parte il sito di taglio dell'enzima ed andrà a legarsi su qeusto frammento
• Per EcoRI: stessa cosa
I primer della fase preselettiva sono complementari al mio adattatore ma hanno un nucleotide in più così da fare un primo screening.
I primer della fase selettiva sono due o tre nucleotididi in più in modo da ridurre ulteriormente i frammenti amplificati, inoltre sono marcati in modo da ottenere visualizzazione dei profili otterremo un pattern di bande estremamente elevato.
Il profilo verrà analizzato grazie ad un software.
Verranno raggruppati in cluster i ceppi geneticamente più vicini.
Si fa un dendrogramma che ha come valore minimo di indice di similarità 0 (completa non correlazione) mentre il massimo è 1 (non distinguibili con questa tecnica perchè ricorda identici non si può dire perchè non si è sequenziato tutto il genoma anche se in effetti ho preso tutto il genoma e vado ad analizzare più di 150 bande ma ciò nonostante non basta questo per dire identici).
E' una metodica utilizzata per identificare i microrganismi non solo per tipizzare.
Vantaggi:
• Dà una resa uguale se non superiore in termini di efficienza, risoluzione e riproducibilità rispetto all'RFLP e alla RAPD;
• Il vantaggio maggiore risiede nella sua sensibilità nel rilevare i polimorfismi presenti nell’intero genoma batterico/fungino;
Limiti:
• Metodica lunga e laboriosa
• Difficoltà interpretative (perchè anche se è il software che li analizza i parametri li mette l'operatore)
• Riproducibilità inter-laboratorio che potrebbe essere potenzialmente elevata se tutti utilizzassero i soliti protocolli dall'isolamento in avanti ma non c'è
• Assenza di un sistema di nomenclatura universale.
