l'analisi del cariotipo si esplica tramite il seguente metodo. Molecole di dimensioni maggiori a 20Kb non vengono risolte con questa tecnica. L’assenza di risoluzione deriva dal fatto che per il DNA il rapporto carica/massa è costante.
l'analisi del cariotipo si esplica tramite il seguente metodo. Molecole di dimensioni maggiori a 20Kb non vengono risolte con questa tecnica. L’assenza di risoluzione deriva dal fatto che per il DNA il rapporto carica/massa è costante.
Molecole corte avranno meno cariche e tenderanno a muoversi più lentamente nel campo elettrico, rispetto a molecole più lunghe, anche se quest’ultime essendo più pesanti eserciteranno una resistenza maggiore.
Il tempo speso da una molecola di DNA per assumere la conformazione allungata necessaria per poter migrare nel reticolo del gel è funzione del suo peso molecolare ed è detta TEMPO DI RI-ORIENTAMENTO.
Il TEMPO DI RI-ORIENTAMENTO può essere utilizzato per la separazione elettroforetica di frammenti di qualsiasi dimensione a condizione che la DIREZIONE DEL CAMPO ELETTRICO VENGA CAMBIATA RIPETUTAMENTE, AD INERVALLI REGOLARI (pulse time).
TANTO PIU’ LUNGA E’ UNA MOLECOLA TANTO MAGGIORE E’ IL SUO TEMPO DI RIORIENTAMENTO.
Un pulse time maggiore del tempo di riorentamento consente la separazione di frammenti di DNA compresi tra 20-800Kb
Con questo pulse time hanno meno probabilità di spezzarsi quando si insinuano nelle maglie rispetto ad una elettroforesi convenzionale dove le molecole si impattano direttamente perchè non c'è alternanza del campo elettrica.
Anche la preparazione de DNA segue un iter particolare un po' laborioso perchè nell'elettroforesi pulsata non caricherò mai un camipone di DNA genomico preparato come visto negli altri casi bensì una sospensione batterica viene inglobata mescolandola insieme ad un agar low-melting (cioè che fonde a bassa temperatura) ed inserita in piccoli pozzettini di uno strumento di plexiglass, viene lasciato un'ora in frigorifero ottenendo così i blocchettini solidificati con dentro la mia sospensione colturale, che io stacco con molta delicatezza.
Tutte le operazioni di lisi della cellula avverranno nel blocchettino trasferendole in varie soluzioni che degraderanno tutti i componenti cellulari lasciando integro il genoma della cellula, i cromosomi.
Poi caricherò un pezzettino di questo blocchettino nel mio gel che avrà perso i componenti cellulari con al suo interno il DNA genomico ed a questo punto si può fare la corsa elettroforetica in campo pulsato.
L'ultima generazione di strumenti è dove in mezzo c'è il blocchetto mentre gli elettrodi sono distribuiti lungo i lati di un esagono e collegato il tutto ad un computer che alterna il campo elettroagnetico e siccome ci vogliono anche ore c'è il rischio di surriscaldamento allora c'è una pompa di refrigerazione. Usata per microbiologia ma anche genetica umana (sindrome di philadelphia ad esempio).
Quindi i problemi dei metodi basati sull'analisi dei profili costituiti da bande di DNA:
• I risultati sono laboratorio-dipendenti
• Assenza di una nomenclatura universale centrale (no database)
Quindi fino ad oggi non si è riusciti a fare indagini epidemiologici su scala globale per esempio per la farmaco resistenza.
