Questo riduce a zero la possibilità dell'errore dovuta ad interpretazione soggettiva perchè non bisogna più dire presenza o assenza di banda ma analizzare la sequenza nucleotidica.
Si basa sulla variazione allelica, sulla presenza di polimorfismi anche in geni altamente conservati come gli housekeeping.
Il numero di frammenti di geni housekeeping varia da 6-7-8 a seconda della specie microbica che vogliamo utilizzare.
Questo riduce a zero la possibilità dell'errore dovuta ad interpretazione soggettiva perchè non bisogna più dire presenza o assenza di banda ma analizzare la sequenza nucleotidica.
Si basa sulla variazione allelica, sulla presenza di polimorfismi anche in geni altamente conservati come gli housekeeping.
Il numero di frammenti di geni housekeeping varia da 6-7-8 a seconda della specie microbica che vogliamo utilizzare.
Uno stretch di circa 500 paia di basi abbia una decina di posizioni dove un ceppo può avere una base ed un altro averne un'altra (polimorfismo).
Quindi devo avere il primer per questi geni, amplificarli, purificarli e sottoporli a sequenziamento.
Ovviamento questo lo devo fare per lo meno per due ceppi sennò che confronto.
Appaio le sequenze dei due ceppi e confronto, se in quele condizioni dove ho i polimorfismi i ceppi sono uguali, i ceppi avranno lo stesso genotipo uguale altrimenti saranno di genotipo diverso.
Ad ogni genotipo assegno un numero in maniera arbitraria e nell'ordine di identificazione.
Da questa comparazione per esempio il secondo ceppo a livello del gene uno un genotipo diverso a livello del gene due magari lo stesso genotipo.
Quindi cnfronto del genotipo ed assegnazione di un numero per ogni genotipo diverso.
Poi uso un parametro chiamato "sequence type" che è dato dalla combinazione di tutti i genotipi che ho ottenuto con tutti i miei frammenti genici.
Quindi ceppo A che ha combinazione 14-10-17-11 a questo genotipo assegno numero 5, naturalmente non è assegnato da e ma da un computer è un esempio.
Il ceppo B nonostante condividesse 2 dei sette genotipi nel parametro ultimo la sequence type è diversa quindi sono ceppi diversi nonostante condividino alcuni genotipi.
Tra i geni conservati alcuni esempi usati sono: aspartato ammino transferasi, mannosio fosfato isomerasi etc.
Questi geni però sono esposti alla giusta rpessione selettiva che permetta quindi una modificazione nucleotidica ma non troppe mutazioni.
Un esempio di gene con troppe mutazioni da evitare è la resistenza o coinvolto nella virulenza o che media l'interazione con l'ospite.
Quindi amplificazione, purificazione del frammento, sequenziamento di ciascuno di questi sette frammenti, non di tutto il gene perchè sarebbe troppo grande da analizzare quindi frammenti molto piccoli per ridurre i tempi ma sufficientemente lunghi da fornire la variabilità.
L'analisi delle sequenze: uno non deve controllare solo la sequenza di basi ma anche il cromatogramma, per gli eucariotici c'è il problema delle eterozigosi e sta a noi decifrare perchè nel cromatogramma in caso di eterozigosi vedo un doppio picco che il computer considera come rumore di fondo sta all'operatore stare attento, questo tipo di limitazione rimane.
Facciamo un esempio per ciascuno dei loci, una volta che ho analizzato tutta la sequenza nel programma non riporterò tutta la sequenza che non mi interessa ma solo le posizioni dove ho i siti polimorfici, a livello di questi siti, per ciascun ceppo, sono analizzati per questo locus e viene riportato il profilo allelico cioè il nucleotide presente a livello dei siti polimorfici per ciascuno di essi ed in base a questo viene assegnato un genotipo.
In caso di eterozigosi si mette queste lettere che corrispondono :
Y=C+T W=A+T R=A+G M=A+C K=G+T
E' una metodica altamente discriminativa.
Se grafichiamo il numero di genotipi per ciascun frammento sul numero di ceppi tipizzati vedo che superando un certo numero di ceppi comincio a non identificare profili nuovi.
Se però metto il numero di ceppi in un grafico con la sequence type ovvero la combinazione di tutti i genotipi ottenuti ottengo un grafico con linea retta che parte dall'origine.
Questi grafici ci permettono di dire che è una metodica adatta.
Arrivando anche a 400 o 500 ceppi tipizzati non otterrò 400 sequence type ma 390 insomma la combinazione dei genotipi garantisce la variabilità ed un potenziale discriminativo così elevato da sfiorare la linearità escludendo i casi isolati dallo stesso paziente che vero similmente sono causati dallo stesso ceppo e stessa sequence type.
Quindi è una metodica con un alto livello discriminativo che consente di riuscire a tipizzare in maniera ottimale la popolazione batterica o fungina in modo ideale.
Il valore numerico del sequence type è un indice assolutivamente arbitrario usato per la relazione genetica tra i ceppi.
Nel 2008 i tipi di specie per le quali posso usare questa tecnica erano 23 nel 2009 erano 25.
Come si usa?
Per esempio per lo streptococcus pneumoniae (l'agente eziologico della polmonite).
C'è una serie di opzioni dove posso anche solo consultare non immettere per forza nuovi ceppi.
Metto le sequenze in alcuni box, dove ciascun box comrpende i lgene housekeeping e poi sarà opera del sistema dietro la quale c'è u ncuratore per ciascun database per valutare la bontà della sequenza per decidere di accettare i dati dopodiche assegna il genotipo confrontandolo con tutti quelli che sono disponibili nel database dando la sequence type.
