C'è un gruppo di studiosi che decide di allestire questo schema.
C'è uno studio molto lungo anche di qualche anno durante il quale deve saggiare una serie di geni housekeeping, abbiamo visto 7 geni ma uno parte da 20-30 geni facendo uno studio pilota li compara su un numero limitato di ceppi che fa venire su aree geografiche diverse valutando se il frammento genico ha una variabilità adeguata per esempio se un solo sito polimorfico viene scartato.
C'è un gruppo di studiosi che decide di allestire questo schema.
C'è uno studio molto lungo anche di qualche anno durante il quale deve saggiare una serie di geni housekeeping, abbiamo visto 7 geni ma uno parte da 20-30 geni facendo uno studio pilota li compara su un numero limitato di ceppi che fa venire su aree geografiche diverse valutando se il frammento genico ha una variabilità adeguata per esempio se un solo sito polimorfico viene scartato.
Altri parametri sono: valutare come l'espressione di questi polimorfismi si evidenziano a livello di modificazioni amminoacidiche, il tasso di variabilità di mutazioni sinonime o non sinonime insomma la progettazione è assai più complessa.
Comunque si sceglie il minimo numero di geni che mi garantisce di ottenere costi bassi ed una variabilità adeguata per questo tipo di tipizzazione viene selezionato e può accedere al database.
Tutti possono accedere a questo database consultarlo o tipizzare il proprio ceppo analizzato con una nomenclatura universale.
Questo consente di stabilire la relazione genetica tra questi ceppi tramite la costruzione di dendrogrammi che raggruppano ceppi geneticamente correlati nello stesso modo in cui si faceva con le metodiche che si son viste l'altra volta la differenza è che invece di confrontare le bande confronto i polimorfismi e vedere se il paziente è stato infettato dallo stesso ceppo o da ceppi diversi.
Su quei ceppi correlati che hanno dei genotipi in comune cioè solo alcune sequenze sono condivise posso usare altri algoritmi come BURST che si basa su sequence type correlate.
Se nel dendrogramma abbiamo individuato un cluster di ceppi vicini questi ceppi posso usalri per un'analisi BURST, per vedere se all'interno di quest ocluster c'è u nceppo ancestrale dal quale gli altri si sono evoluti sotto la spitna selettiva modificando uno degli alleli (un genotipo) o modificandone due.
L'output del programma è un disegno ad anelli concentrici all'interno dei quali c'è la sequence type di ciascun microrganismo al centro c'è il ceppo ancestrale che in base a questa analisi viene identificato come ceppo padre dei ceppi dai quali gli altri si sono evoluti cambiando un singolo allele nel primo cerchio o due variazioni alleliche nel secondo cerchio.
E' importante perchè in un cluster clonale ad esempio di Staphilococcus aureus, in blu le sequence type suscettibile alla meticillina mentre rosso la sequence type del ceppo resistente alla meticillina al centro dove c'è il ceppo ancestrale suscettibile alla meticillina.
Però al centro dello stesso ceppo ancestrale c'è un'altra sequence type rossa un ceppo resistente, questo è possibile perchè la meticillino-resistenza è molto frequentemente dovuta all'acquisizione di un plasmide, di un elemento mobile.
L'acquisizione di un plasmide non è distinguibile da un MLST avranno la stessa sequence type.
Da questa sequence type ancestrale arriva un'altra sequence type perchè questo ceppo si è riorganizzato ed è mutato qualcosa rilevabile dalla MLST.
Quest'ultimo che deriva fa da ceppo ancestrale per altri ceppi tutti meticillino-resistenti.
Sempre dal primo cluster se ne forma un terzo cluster dovuto alla modificazione di un altro gene.
Con questa metodica posso seguire e monitorare lo sviluppo di fenotipi associati a diverse sequence type.
In un altro caso sempre su staphilococcus aureus si è visto che la virulenza derivava dal ceppo ancestrale però veniva persa man mano che si creavano mutazioni dal ceppo ancestrale, cosa opposta a quell odella resistenza che invece era un caso di acquisizione.
Lo schema a volte invece di centri concentrici posso avere punti collegati da linee la cui lunghezza varia a seconda dellla variazione allelica.
Altri modi per analizzare i dati valutare se è possibile raggruppare i gruppi correlati con un albero in modo da mettere in evidenza raggruppamenti maggiori chiamati clade.
Prescindendo la parte clinica e vedendo più la genetica di popolazione uno potrebbe anche valutare se una determinata popolazione microbica ha una determinata riproduzione clonale oppure ricombina anche fare studi di genetica della popolazione.
Gli svantaggi sono:
• I dati ottenuti mediante MLST sono una approssimazione dei polimorfismi dispersi su tutto il genoma
• I ceppi saranno INDISTINGUIBILI per MLST ma non necessariamente identici
I vantaggi sono:
• L’automatizzazione dei processi di sequenziamento e di analisi delle sequenze dei frammenti genici elimina l’interpretazione soggettiva dei dati
• I profili allelici ottenuti per i ceppi analizzati mediante multi-locus sequence typing possono essere archiviati in un database centrale, accessibile e consultabile da tutti i laboratori del mondo via Internet
• Creazione di un sistema di nomenclatura universale.
