A livello trascrizionale si può distinguere tra geni cry sporulazione dipendenti e sporulazione indipendenti.
La sintesi è regolata da specifici fattori sigma, che legano la RNA polimerasi e promotori sporulazione specifici o non:
Un esempio è il Gene cry1Aa espresso nella cellula madre, grazie alla presenza di due promotori BI (attivo solo dalla fase T2 alla T5 della sporulazione e viene riconosciuto da sigma 35) e BII (attivo dalla fase T5 della sporulazione in poi ed è riconosciuto da sigma28)
A livello trascrizionale si può distinguere tra geni cry sporulazione dipendenti e sporulazione indipendenti.
La sintesi è regolata da specifici fattori sigma, che legano la RNA polimerasi e promotori sporulazione specifici o non:
Un esempio è il Gene cry1Aa espresso nella cellula madre, grazie alla presenza di due promotori BI (attivo solo dalla fase T2 alla T5 della sporulazione e viene riconosciuto da sigma 35) e BII (attivo dalla fase T5 della sporulazione in poi ed è riconosciuto da sigma28)
un altro esempio è il Gene cry3A’ espresso in fase vegetativa, promotore riconosciuto da sigma A (non sporulazione specifico).
Al controllo trascrizionale segue un controllo post-trascrizionale volto a proteggerlo finchè questo messaggero sia ampiamente tradotto.
Meccanismi post-trascrizionali: Emivita mRNA per le tossine= circa 10 minuti (5 volte maggiore rispetto ai normali messaggeri batterici).
Questi messaggeri hanno anche degli elementi protettivi che li proteggono dalla degradazione:
• AL 3’ il terminatore (stem loop) agisce come regolatore positivo impedendo la degradazione esonucleasica
• AL 5’ E’ presente una sequenza SHINE DALGARNO (STAB-SD) tra promotore e codone d’inizio importante per l’accumulo di mRNA e sua stabilità all’estremità 5’
Meccanismi post-traduzionali: Le proteine Cry formano spontaneamente inclusioni cristalline, non sono necessari fattori dell’ospite per l’assemblamento, riducendo la suscettibilità alla degradazione proteolitica prematura perchè poi una degradazione ci dovrà essere ma non finchè non raggiungono l'intestino dell'insetto.
Forme:
• Cry1—> bipiramidale
• Cry2—> cuboidale
• Cry3A--> rettangolare
• Cry3B--> irregolare
• Cry4A eB --> sferica
• Cry11 A--> romboidale
I cristalli sono solubilizzati nell’intestino di larve di insetti , divenendo biologicamente attive
Struttura CRISTAL PROTEIN:
Esempio: Cry1A e Cry3A struttura tridimensionale simile, composta da 3 domini:
Dominio II: (loop region, 3 foglietti beta antiparalleli): coinvolto nel legame con il recettore ruolo B-binding (somiglianza con i siti leganti di anticorpi)
Dominio III (2 giri di foglietti beta che formano un beta sandwich): coinvolto nel legame con il recettore specifico e nella protezione delle porzioni attive (dominio I) della tossina da parte di proteolisi nell’intestino dell’insetto
Dominio I (7 alfa eliche antiparallele): coinvolto nell’inserimento all’interno della membrana cellulare, formazione di pori litici nell’epitelio intestinale. Mutanti nel dominio I perdono la tossicità il dominio I è la porzione realmente attiva.
Storicamente il bacillus turingiensis era utilizzato quasi esclusivamente nei confronti dei lepidotteri ma dal '77 trovati dei bacilli turingiensis contro alcune famiglie di ditteri ed altri ceppi attivi contro: coleotteri, nematodi, pidocchi, afidi e formiche.
Sono stati isolati 80 sierotipi diversi e sono state identificati più di 170 geni codificanti per le endotossine.
La ricerca è volta ad individuare nuovi ceppi per diversi insetti patogeni delle piante.
Maccanismo d'azione:
L'azione tossica è dovuta a questi cristalli parasporali (delta-endotossine).
Il principio si basa sul fattoche questi cristalli devono rimanere integri finchè non raggiungono l'intestino dell'insetto dove provocano dei danni tali in modo che la larva smette di alimentarsi muore più lentamente o altrimenti i danni sono tali da provocare rapida morte.
Praticamente sono protossine finchè le reazioni chimiche che avvengono nell'intestino dell'insetto diventano vere e proprie tossine attive.
Parte della tossina può non essere assorbita dall'insetto per continue reazioni proteasiche però una buona parte sarà assorbita.
Questa endotossina interagisce con recettori specifici presenti sul tessuto epiteliale dell' intestino della larva e questo darebbe la specificità di azione su un'insetto rispetto ad un altro.
Questa tossina crea i seguenti danni: squilibrio elettrochimico, paralisi intestinale o distruzione dell'emolinfa.
Effetti rapidi dalle 24 alle 96 ore per morire.
• Le larve ingeriscono i cristalli di BT a seguito della loro attività trofica
• Grazie al ph alcalino (maggior di 9) presente nell'intestino delle larve dei lepidotteri con successiva degradazione della delta-endotossina
• Gli enzimi presenti nell'intestino attivano le tossine che a loro volta si leganoa rcettori specifici
• Gravi danni alle cellule dell'apparato intestinale
• Le spore del BT invadono il resto della larva provocandone la morte per setticemia emolinfatica e paralisi dell'apparato intestinale
Effetti istologici:
Vacuolizzazione a livello delle cellule epiteliali dell'intestino di zanzara fino alla compelta scompaginazione del microvillo, fuoriuscita del citoplasma e paralisi intestinale.
Ingegnerizzazione delle piante per far esprimere loro una tossina di Bacillus turingiensis per valutare se questa tecnica poteva essere utile nel controllare l'attacco di questi insetti.
Su un esperimento fatto su foglie di tabacco e di barbabietola: senza tossina la larva la mangiava con tossina la foglia rimaneva intatta.
Si è pensato di creare anche ceppi ingegnerizzati con l'espressione di tossine diverse.
Impiegando questo tipo di tecnica lo sviluppo di resistenza alla tossina di BT è proprio minima solo due insetti hanno sviluppato resistenze:
• falena
• bruco del cavolo
Se si fa esprimere però due tossine diverse consentiva di impedire che questa resistenza si manifestasse consentiva di uccidere comunque l'insetto.
Una delle ditte che oggi produce un biopesticida basato sul BT è la "Syngenta".
