Metodo Maxam e Gilbert di sequenziamento
Questo metodo si basa sulla marcatura terminale al 5’ o al 3’ del DNA a doppio filamento (con 32P), seguita dalla denaturazione e separazione dei due filamenti.
Suddivisione dei campioni di Dna
Il DNA a singola elica viene suddiviso in quattro campioni, ognuno dei quali viene trattato con un reagente chimico che demolisce una o due delle 4 basi del DNA:
- G trattata con DMS + piperidina;
- G + A trattate con DMS + piperidina + acido formico;
- C + T trattate con idrazina + piperidina;
- C trattata con idrazina + piperidina in NaCl 1,5 M.
Frammentazione
Le reazioni sono controllate in modo da avere una frammentazione parziale: statisticamente tutte le possibili basi saranno degradate producendo una serie di frammenti la cui lunghezza dipenderà dalla distanza tra l’estremità marcata e il sito di taglio.
La separazione dei frammenti marcati avviene mediante gel elettroforesi e la visualizzazione dei risultati mediante autoradiografia.
