I batteriofagi sono virus in grado di infettare I batteri; si utilizzano quando il frammento di DNA da clonare è troppo grande per utilizzare vettori plasmidici ( librerie di DNA).
Il fago
Il fago presenta una testa con capside, in cui è inserito il DNA, una coda e dei filamenti. Il fago inietta il proprio DNA nella cellula batterica; il DNA virale può essere integrato nel DNA batterico e rimanere silente (via lisogenica) o può replicarsi autonomamente, sfruttando gli organelli dell’ospite (via litica).
Il più grande vantaggio dei vettori fagici è la loro alta efficienza di trasformazione, circa 1000 volte maggior di un vettore plasmidico.
La regione al centro del genoma virale (25kB circa) può essere rimpiazzata con DNA ricombinante, perché porta geni che non sono essenziali per il virus. Dopo l’assemblaggio in vitro, il virione che porta il DNA ricombinante può trasferire il DNA nella cellula batterica.
Fago lambda
Le estremità del DNA del fago lambda sono coesive, dette siti COS; il braccio sinistro contiene geni che codificano per proteine strutturali della testa e della coda; il braccio destro contiene geni per il ciclo litico e la replicazione del DNA; la parte centrale, che può essere sostituita, contiene i geni per il ciclo lisogeno; non utile allo scopo.
L’assemblaggio delle particelle fagiche ricombinanti avviene in vitro. Il fago λ viene cresciuto in laboratorio su una patina di cellule batteriche. I batteri e le particelle di fago λ vengono mescolate con del top di agar liquido,non troppo caldo. La sospensione viene versata su una piastra di agar già pronta, sulla quale viene lasciato solidificare il top. La piastra è quindi incubata per 12-16h a 37°C. Le placche di fago appaiono come cerchi torbidi nella patina batterica.
cosa sono i Siti COS
Le estremità del DNA virale sono chiamate siti COS, ognuno a singolo filamento lungo 12 nucleotidi. Dato che le loro sequenze sono complementari l’una con l’altra, la fine di un DNA-λ potrebbe accoppiarsi con l’estremità opposta di un’altro DNA-λ, formando delle catene. Le due estremità del DNA-λ potrebbero anche unirsi tra loro, formando un DNA circolare.nella cellula ospite il DNA-λ circolarizza per effetto della ligasi.
Nel processo di assemblaggio del virione due proteine Nuλ e A possono riconoscere il sito COS, dirigendo l’inserzione del DNA-λ tra loro, in una testa vuota. La testa riempita è poi unita alla coda, formando il virione-λ maturo. Le proteine Nuλ e A sono codificate dai geni del genoma del fago. Se i due geni sono mutati, il DNA-λ non può essere impaccato nella testa pre-assemblata. Dato che la coda si unisce solo alle teste piene, la cellula accumulerà parti separate di teste e code, che possono essere estratte. Quando l’estratto è unito al DNA ricombinante ed alle proteine Nuλ e A verrà assemblato il virione-λ maturo, che porta il DNA ricombinante.
