I plasmidi sono molecole di DNA circolare a doppio filamento che esistono nei batteri e nei nuclei di alcune cellule eucariotiche; sono in grado di replicarsi indipendentemente dalla cellula ospite e la loro dimensione varia da poche kB a circa 100kB. Un tipico vettore plasmidico contiene una regione polilinker che può riconoscere diversi enzimi di restrizione, un gene di resistenza all’ampicillina (ampr) per l’amplificazione selettiva e un’origine di replicazioni (ORI) per la proliferazione nella cellula ospite.
Il plasmide e il DNA da inserire vengono trattati con lo stesso enzima, così da presentare estremità “appiccicose” e compatibili; si ah poi l’appaiamento delle estremità complementari e, tramite l’intervento della DNA ligasi, l’unione dei frammenti.
Tipologie di plasmidi
Si dividono in plasmidi ad elevato numero di copie e plasmidi a basso numero di copie.
Plasmidi ad elevato numero di copie
La replicazione dei plasmidi ad elevato numero di copie avviene più frequentemente rispetto a quella del DNA cromosomico (alta resa).
Plasmidi a basso numero di copie
La replicazione nei plasmidi a basso numero di copie avviene con la stessa frequenza del DNA cromosomico.
Plasmidi a specificità d’ospite limitata
Possono essere classificati anche in base alla specificità d’ospite.
Si dicono a specificità d’ospite limitata quei plasmidi che sono in grado di replicarsi in un numero limitato di specie batteriche e (per es. PBR322 e PUC18 si replicano solo in E.Coli).
Plasmidi a largo spettro d’ospite
Si dicono a largo spettro d’ospite quei plasmidi che sono in grado di replicarsi in una vasta gamma di specie batteriche. Questi plasmidi possiedono geni per il riconoscimento dell’origine di replicazione e dipendono meno dall’apparato replicativo dell’ospite batterico.
Requisiti di un plasmide per il clonaggio
I requisiti di un plasmide per il clonaggio sono:
- Piccole dimensioni per aumentare l’efficienza della trasformazione
- Presenza dell’origine di replicazione (ORI)
- Presenza di un buon numero di siti di restrizione unici (polylinker)
- Presenza di marcatori genetici specifici che consentano la selezione delle cellule batteriche in cui la trasformazione sia avvenuta correttamente.
I plasmidi presenti nelle cellule ospiti possono essere ricombinanti ma anche plasmidi che non hanno inglobato il DNA estraneo. Anche selezionando le cellule ospiti con un antibiotico, sopravvivono tutte quelle che presentano il plasmide, ricombinante o meno. In questo caso si può fare una selezione per inattivazione inserzionale.
Si può usare un plasmide PBR322 come vettore, questo contiene sia il gene amp, che conferisce resistenza all’ampicillina codificando per la beta-lattamasi, sia il gene Tc, che conferisce resistenza alle tetracicline codificando per un trasportatore di membrana che espelle l’antibiotico dalla cellula. Un altro metodo utilizza il plasmide pUC19, che presenta il gene LacZ che codifica per l’enzima β-galattosidasi. Questo enzima è in grado di demolire il substrato cromogeno X-Gal con la produzione di una colorazione blu.
Come evitare che il plasmide si richiuda su se stesso?
Per evitare che il plasmide si richiuda su se stesso si può digerire il frammento ed il plasmide con due enzimi diversi, in modo che le estremità 5’ e 3’ del vettore non siano compatibili; oppure si può trattare il plasmide, prima della ligazione, con fosfatasi alcalina che rimuove I gruppi fosfato al 5’; ciò impedisce la reazione di ligasi del plasmide se non è presente l’inserto, che possiede i fosfati in 5′.
I batteri competenti
I batteri in grado di assumere DNA dall’ambiente vengono definiti competenti. Solo pochi batteri hanno una competenza naturale, la maggior parte dei batteri deve sviluppare la competenza; ciò avviene tramite il trattamento con soluzioni fredde di ioni bivalenti (Ca2+).
