Che cos’è il metodo di Sanger
Questo metodo coinvolge la sintesi di nuovi filamenti di DNA complementari ad uno stampo a singolo filamento. Nel sequenziamento a terminazione di catena la reazione, oltre ad uno stampo a singola elica, ha bisogno di: un innesco specifico (primer); la marcatura con un desossinucleotide-trifosfato marcato di solito con 32S; una DNA polimerasi con elevata processività e bassa attività esonucleasica (sia in direzione 5’-3’, sia in direzione 3’-5’).
Questo metodo necessita anche di terminatori specifici dell’allungamento della catena di DNA: i 2’-3’-didesossinucleoside trifosfati (ddNTP).
Le 4 reazioni
La sintesi del filamento complementare inizia dopo l’unione del primer allo stampo di DNA ma la DNA polimerasi non prosegue indefinitamente, perché la miscela di reazione contiene, in quattro distinte reazioni, piccole quantità di specifici dideossinucleotidi-trifosfato (ddATP, ddTTP, ddCTP e ddGTP) che bloccano l’allungamento perché posseggono un solo atomo di idrogeno al posto del gruppo -OH in 3’. Il risultato di ogni reazione è una serie di frammenti interrotti ciascuno in corrispondenza di ogni ddNTP (in base a quello introdotto nella miscela).
I frammenti ottenuti possono essere separati per elettroforesi su gel di poliacrilamide. Il gel viene seccato e se ne fa una lastra autoradiografica; il 35S presente emette radiazioni che impressionano la lastra, evidenziando i nucleotidi marcati. Il sequenziamento si fa dai risultati dell’elettroforesi, partendo dal fondo della lastra (dal frammento più piccolo) e risalendo man mano. La sequenza ottenuta in questo caso è 5′-CCGATTG.
L’impiego di dideossinucleotidi
4 reazioni perchè 4 nucleotidi 4 primer modificati.
Sottoponendo poi a migrazione elettroforetica le 4 reazioni, si legge partendo dal basso su queste lastre autoradiografiche risalendo in ordine di apparizione dei frammenti.
Metodo tutt’ora utilizzato, ora le 4 reazioni possono essere mescolate insieme perchè si usano 4 fluorocromi diversi e non c’è più la lastra ma un file che si può utilizzare con programmi specializzati.
