Enzimi di Restrizione
Per inserire il frammento di DNA all'interno di un vettore plasmidico si sfruttano alcuni enzimi chiamati endonucleasi di restrizione; questi enzimi tagliano il legame fosfodiestere all'interno del DNA, in sequenze specifiche chiamate siti di restrizione.
Le endonucleasi I tagliano in un sito casuale utilizzando ATP; le endonucleasi IIdanno frammenti specifici ed hanno funzione di metilasi, non necessitano di ATP; le endonucleasi III tagliano 24-26 coppie di basi a valle del sito di riconoscimento ma necessitano di ATP.
Per inserire il frammento di DNA all'interno di un vettore plasmidico si sfruttano alcuni enzimi chiamati endonucleasi di restrizione; questi enzimi tagliano il legame fosfodiestere all'interno del DNA, in sequenze specifiche chiamate siti di restrizione.
Le endonucleasi I tagliano in un sito casuale utilizzando ATP; le endonucleasi IIdanno frammenti specifici ed hanno funzione di metilasi, non necessitano di ATP; le endonucleasi III tagliano 24-26 coppie di basi a valle del sito di riconoscimento ma necessitano di ATP.
Le endonucleasi II sono enzimi batterici che degradano il DNA virale dei batteriofagi e riconoscono sequenze di 4, 6 o 8 coppie di nucleotidi; il taglio che si ottiene è sfalsato e le estremità sono dette “appiccicose”, queste endonucleasi riconoscono solo sequenze non metilate.
Gli isoschizomeri sono enzimi di restrizione che riconoscono la stessa sequenza; gli isocaudameri riconoscono siti diversi, ma lasciano estremità compatibili.
La separazione e l'analisi del DNA tagliato dagli enzimi di restrizione vengono fatte tramite elettroforesi su gel di agarosio, che separa le molecole di DNA in base alla lunghezza, facendole migrare in un campo elettrico. Per visualizzare il DNA si usa il bromuro di etidio, una molecola intercalante che risulta fluorescente alla luce ultravioletta.
Dallo studio del risultato dell'elettroforesi si può ottenere una rappresentazione grafica della localizzazione dei siti di restrizione all'interno del DNA.
Campioni di DNA trattati con enzimi diversi vengono messi ad incubare, successivamente si effettua un'elettroforesi su agarosio. In base alla distribuzione delle bande si possono riorganizzare i frammenti di DNA per capire in quali punti operano gli enzimi e, di conseguenza, dove sono collocati i siti di restrizione del DNA.
