Metodi di Trasformazione
I metodi di trasformazione delle cellule ospiti sono distinti in metodi fisici, come lo shock termico, l'elettroporazione e la microiniezione; metodi chimici come la trasformazione con CaCl2e il metodo di Hanahan; o metodi biologici come la lipofezione.
I metodi di trasformazione delle cellule ospiti sono distinti in metodi fisici, come lo shock termico, l'elettroporazione e la microiniezione; metodi chimici come la trasformazione con CaCl2e il metodo di Hanahan; o metodi biologici come la lipofezione.
TRASFORMAZIONE CON CaCl2.Le cellule batteriche vengono raccolte quando sono ancora in fase di crescita logaritmica; la coltura viene centrifugata e sospesa in CaCl2, tenuta in ghiaccio per almeno un'ora; alle cellule competenti si aggiunge il DNA della miscela di ligazione e si lascia il tutto nel ghiaccio, così da permettere l'ingresso del DNA ricombinante. Successivamente si utilizza lo shock termico, 1 minuto a 42°C, per favorire l'ingresso del plasmide; si lasciano le cellule a 37°C il tempo necessario a far esprimere il gene per la resistenza all’antibiotico; si dispensano aliquote di cellule su piastre di terreno LB solido, per le colture batteriche, contenenti l’antibiotico appropriato; e, dopo una notte in incubazione a 37°C, si ottengono colonie da vagliare per la presenza di DNA ricombinante.
ELETTROPORAZIONE.Le cellule batteriche vengono mescolate con il DNA ricombinante plasmidico; il mix ottenuto viene posto in cuvette munite di elettrodi connessi ad un alimentatore; si induce un breve impulso elettrico che apre transitoriamente dei pori nella membrana cellulare attraverso i quali entra il plasmide.
LIPOFEZIONE.Il DNA può essere incorporato entro vescicole lipidiche artificiali dette liposomi.In questo caso le cariche del DNA sono schermate e la vescicola lipidica, fondendosi con la membrana batterica, permette l'ingresso del DNA nella cellula. È stato sviluppato un certo numero di metodi allo scopo di incapsulare il DNA in doppi strati lipidici sintetici che assomigliano a membrane cellulari. Questi liposomi sono essenzialmente delle sferette di membrane sintetiche, che possono essere riempite di DNA, le quali si fondono spontaneamente con le membrane cellulari, scaricando il loro contenuto nel citoplasma. Produrre dei liposomi ex novo è complicato, ma sono disponibili in commercio dei reagenti che semplificano notevolmente la procedura.
