Elettroforesi

L’elettroforesi del siero analizza le proteine presenti nel siero del sangue. Le proteine del siero sono importantissimi valori, che possono mettere in luce un gran numero di malattie.

L’elettroforesi del siero analizza le proteine presenti nel siero del sangue. Le proteine del siero sono importantissimi valori, che possono mettere in luce un gran numero di malattie.

La maggior parte di queste proteine viene prodotta dal fegato e alcuni tipi di proteine vengono rilasciate nel sangue da cellule del sistema immunitario, cioè il sistema delle difese naturali dell’organismo. È un esame che deve essere effettuato a digiuno.

L’uso di antibiotici può dare dei risultati non corretti. Con questo esame vengono individuate, in particolare, le seguenti proteine (vedere le singole voci): albumina, alfa 1 globuline, alfa 2 globuline, beta globuline, gamma globuline.

 

 

L'elettroforesi su gel è una tecnica per separare molecole cariche di dimensioni diverse.

Sono comunemente usati due tipi di gel: agarosio e poliacrilamide. Il gel di agarosio può essere applicato a una gamma più ampia di formati rispetto al gel di poliacrilammide. Usando gel standard di agarosio possono essere separati acidi nuclei fino a. 50 kb.

Se viene utilizzata l'elettroforesi su gel in campo pulsato, il limite superiore di separazione può essere esteso a 10 Mb. Il gel di poliacrilammide può separare gli acidi nucleici che differiscono in lunghezza di un solo nucleotide se la loro lunghezza è inferiore a 500 bp.

La poliacrilammide è un polimero costituito da acrilammide e metilen-bis-acrilammide e viene fatto polimerizzare per l'azione di un catalizzatore, ammonio persolfato, e di un acceleratore, TEMED.

La polimerizzazione non è omogenea se è presente ossigeno, quindi la soluzione in tampone va rapidamente degassata e versata tra due lastre di vetro. L'elettroforesi su poliacrilammide è sempre in verticale.

Con l'elettroforesi su agarosio, attraverso la rivelazione con bromuro di etidio, possono essere riconosciuti segmenti di DNA anche di 5-10ng. Acidi nucleici specifici possono essere riconosciuti solo trasferendoli su una membrana di nitrocellulosa e ibridizzandola con sonde di DNA radiomarcate.

La migrazione è influenzata anche dallo stato del DNA, il DNA rilassato circolare migra più lentamente del DNA lineare e di quello superavvolto.

Il trasferimento del DNA a membrane di nitrocellulosa e il rilevamento delle sequenze con sonde oligonucleotidiche radiomarcate prende il nome di Southern-blot; se eseguito sul RNA prende il nome di Northern blot; se eseguito con proteine viene chiamato Western-blot.

L'elettroforesi in campo pulsante è una tecnica particolare che permette la discriminazione di frammenti più grandi di 20kB; questo metodo prevede due set di elettrodi ad angoli opposti che funzionano ad intervalli definiti. La separazione è basata sull'abilità del DNA più piccolo di riorientarsi nel campoelettrico più velocemente del DNA più grande. In questo modo possono essere separati DNA grandi fino a 10MB.

 

 

 

L'Elettroforesi dell'Emoglobina permette di distinguere emoglobine anomale permettendo la diagnosi di diverse emoglobinopatie, in particolare modo per la diagnosi delle talassemie.

E' consigliabile eseguire il prelievo a digiuno da 8 ore.

Esami collegati: Emocromo, Emoglobina Fetale, Emoglobina A2.

 

 

L'Elettroforesi delle Proteine Sieriche permette di identificare le albumine, le alfa1-globuline, le alfa2-globuline, le beta-globuline e le gamma-globuline.

Variazioni nelle percentuali di tali frazioni sono caratteristiche di diversi stati patologici. L'albumina aumenta nella deidratazione e diminuisce in una ampia varietà di patologie subacute, subcroniche e croniche, incluse patologie del fegato, renali e gastrointestinali, malnutrizione e cachessia.

Le alfa 1 globuline sono aumentate in caso di patologia infiammatoria o neoplastica attiva. Le alfa 2 globuline sono aumentate nelle neoplasie, nella febbre reumatica, nella sindrome nefrosica, nel diabete mellito, in gravidanza. Le gamma globuline comprendono IgG, IgA, IgM, IgD, ed Ige.

Una elevazione diffusa policlonale e' segno di un processo immunologico cronico (cirrosi ed epatite cronica attiva), patologie del collageno, patologie infettive, stati infiammatori, neoplasie.

Si richiedono almeno 8 ore di digiuno prima del test e una dieta povera di grassi nei giorni che lo precedono.

 

L’elettroforesi è definita come la migrazione di particelle sotto l’influenza di un campo elettrico.
La mobilità della particella dipende dalla forza elettrostatica netta che agisce sulla particella.
Nell’elettroforesi su gel c’è un mezzo di supporto che agisce impedendo disturbi meccanici e di convenzione durante la migrazione e che serve da setaccio molecolare per separare le molecole, provviste della stessa carica, in base alle dimensioni.
La matrice può essere costituita da poliacrilammide, agarosio o una miscela di questi.
I gel di agarosio sono largamente impiegati per separare molecole di DNA di dimensioni maggiori di 100 bp, si ricorre ai gel di acrilammide quando serve una risoluzione maggiore per frammenti di DNA di piccole dimensioni.
L’agarosio è un polisaccaride lineare purificato dall’agar-agar delle alghe rosse; è solubile in acqua bollente e quando la soluzione si raffredda si forma un gel a causa della formazione di legami idrogeno tra le catene polimeriche dell’agarosio.
Solitamente la preparazione di gel d’agarosio richiede pochi minuti:

a) si pesa l’agarosio
b) si aggiunge l’adeguata quantità di tampone TBE (Tris-BORATE -EDTA)
c) si scioglie l’agarosio
d) si aggiunge bromuro d’etidio (colorante che si lega al DNA intercalandosi tra le basi complementari e mostra una forte fluorescenza quando illuminato con luce UV) in concentrazione pari a 0.5-1mg/ml
e) si lascia solidificare il gel
f) il DNA viene addizionato di una soluzione tampone contenente il 30% di glicerolo e, solitamente, blu di bromofenolo e xilene cianolo

Il gel viene posto nella camera di corsa, si carica il campione e si attende che il DNA migri verso il polo positivo (i coloranti addizionati indicano l’avanzamento del campione nel gel).
In alcuni casi è necessario recuperare il DNA dopo la corsa elettroforetica: il frammento di DNA di interesse viene tagliato dal gel, posto su un transilluminatore, con un bisturi e posto in una microprovetta.
La matrice di agarosio viene sciolta in un bagnetto termostatato, la soluzione ottenuta viene caricata su una resina.
Solo il DNA resta legato alla resina mentre il resto (agarosio e sali) viene rimosso tramite tamponi di lavaggio contenenti Sali e etanolo Si lascia evaporare l’etanolo e si eluisce il DNA con acqua.

L’elettroforesi può essere su gel verticale o orizzontale.
a) Elettroforesi su gel verticale: il gel viene formato tra due lastre di vetro che sono mantenute verticali parallele e separate da sottili spaziatori.
Un pettine di plastica viene sistemato nella soluzione prima che polimerizzi in modo da costruire i pozzetti per il caricamento del campione.
Preparata la matrice, questa viene posta nella vasca di corsa che, inferiormente viene riempita di tampone.
Nella parte che sovrasta il gel si crea una nuova vasca che viene anche essa riempita di soluzione tampone;
qui sono immersi gli elettrodi.
L’alimentatore fornisce corrente agli elettrodi, nella soluzione tra gli elettrodi la corrente viene condotta dagli ioni del tampone.

Le particelle caricate si muovono nel gel in funzione della loro carica e massa molecolare.
Qualora si debbano separare delle proteine si può condurre un elettroforesi denaturante o nativa. Nell’elettroforesi denaturante i campioni proteici, prima del caricamento su gel vengono trattati con un tampone contenente β-mercaptoetanolo e SDS e riscaldati a 100°C.
In questa situazione tutte le proteine, cariche negativamente e denaturate, si spostano nel gel solo in funzione del peso molecolare delle subunità che le costituiscono.
Nell’elettroforesi nativa, invece, i campioni non vengono denaturati né caricati negativamente prima della corsa: la velocità di migrazione pertanto sarà il risultato della massa molecolare del campione e della sua carica intrinseca.

b) Elettroforesi su gel orizzontale: Il gel in questo caso viene colato in una vaschetta fornita di un pettine in modo da creare i pozzetti di caricamento e fatto correre in orizzontale in una cella elettroforetica riempita preventivamente di tampone di corsa.

 

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