Meccanismi Biochimici Apoptosi

Gli enzimi principalmente implicati nel processo apoptotico sono le CASPASI (cystenyl aspartate-specific proteinase): sono proteasi che contengono cisteina e che tagliano a livello dei residui di aspartato. Le caspasi sono anche coinvolte nell’ infiammazione e trasformano alcune interleuchine dalla forma inattiva a quella attiva.

apoptosi

Caspasi

Le caspasi sono molto selettive: effettuano tagli solo su particolari sequenze tetrapeptidiche e solo se esse sono esposte. Si ritiene che nella cellula ci siano soltanto circa 300 sequenze che posseggono queste caratteristiche.

Poiché l’apoptosi è un processo molto delicato, esso è finemente controllato. Per quanto riguarda specificatamente le caspasi il metodo di controllo è rappresentato dalla proteina IAP (proteine che inibiscono l’apoptosi) la quale, legando le caspasi, le inattivano.

La grande famiglia delle caspasi coinvolte nell’ apoptosi si divide in caspasi effettrici (2;3;6;7) ed iniziatrici (8;9;10;12). Tutte le caspasi esistono in una proforma non attiva che contiene acido aspartico.

Caspasi iniziatrici

Le caspasi iniziatrici sono attivate mediante un processo di “prossimità”: se esse vengono concentrate una vicina all’ altra la debole attività proteolitica che possiede la forma inattiva è sufficiente perché gli enzimi si clivino e attivino a vicenda.

Caspasi effettrici

Ciò non è vero per le caspasi effettrici, che vengono attivate soltanto per proteolisi da parte di altri enzimi. Una volta che ciò è avvenuto esse dimerizzano ed espongono i siti attivi.

Via estrinseca apoptosi

Il processo dell’apoptosi comincia col legame da parte di un “recettore di morte” trimerico (il prototipo è il recettore per il TNF o per FAS). Il recettore quindi recluta delle “proteine adattatrici” dimeriche: esse contengono due domini, uno che lega il recettore, l’altro che lega le caspasi 8. Le caspasi 8 quindi si attivano per prossimità.

Le caspasi iniziatrici, una volta attivate, clivano e attivano le caspasi effettrici: le caspasi 3.

Apoptosi via intrinseca

La caspasi iniziatrice è la caspasi 9 e quella effettrice è la caspasi 3. La caspasi 9, pur essendo un’iniziatrice, non si attiva per prossimità è attivata da un complesso composto da CARD, APAF1 e CARD+PROTEASI 9. Questa “piattaforma”, normalmente inattiva, è attivata dal citocromo C e dalla dATP (oppure semplice ATP ma in concentrazioni maggiori).

I mitocondri, oltre al citocromo C, rilasciano anche altri composti come la proteina SMAC che inattiva IAP e rende disponibili sia la procaspasi 3 che la 9.

Mitocondri apoptosi

Un altro fattore importante è il fatto che i mitocondri, attraverso la produzione di ATP, influenzano il pattern della morte cellulare: difatti se c’è abbastanza ATP la cellula va in apoptosi ma se non ce n’è abbastanza per attivare la piattaforma per la conversione della caspasi 9 allora la cellula va in necrosi perché i mitocondri danneggiati non forniscono più energia alla cellula.

Proteina bax

Un meccanismo di controllo della via intrinseca è costituito dalle proteine Bax e Bcl-2.  La proteina Bcl-2 (B cell linfoma 2) è una proteina in grado di immortalizzare le cellule perché, posizionandosi sulla membrana mitocondriale esterna rende difficoltoso il rilascio del citocromo C. Effetto opposto ha invece la proteina Bax che favorisce il rilascio. Dal rapporto reciproco tra le due proteine dipende se la cellula potrà andare in apoptosi o meno.

Collegamento tra via intrinseca ed estrinseca

Le due vie, intrinseca ed estrinseca, comunicano attraverso la proteina BID, anch’essa appartenente alla famiglia di Bcl-2.

BID è un substrato della caspasi 8: BID, clivata dalla caspasi 8 si trasforma in t-BID che trasloca nella membrana esterna dei mitocondri e favorisce il rilascio del citocromo C. Ci sono dei tessuti in cui non è possibile attivare la caspasi 3 se non viene coinvolta la via intrinseca attraverso la proteina BID.

Attivazione della via mitocondriale

1. VIA DI BID: la caspasi 8 cliva BID. tBID va nei mitocondri  e nella membrana esterna si formano tetrameri di BID e BAX. Ciò provoca la formazione di fori sufficientemente grandi per il passaggio del citocromo C. Tuttavia i fori potrebbero non essere sufficientemente grandi da permettere il passaggio di SMAC e quindi la sola via di Bid potrebbe non essere sufficiente a determinare l’apoptosi (difatti la ciclosporina non blocca la via di BID ma tuttavia previene l’apoptosi. Vedi oltre).

2. VIA DELLA PERMEABILIZZAZIONE DELLA MEMBRANA ESTERNA o TRANSIZIONE DI PERMEABILITA’ DI QUELLA INTERNA.

Il citocromo C è l’unico componente della catena respiratoria solubile: la membrana esterna ha il compito di contenerlo dentro il mitocondrio. La membrana interna invece è come un piccolo condensatore perché riesce a separare le cariche positive da quelle negative.

Quando la catena respiratoria non funziona l’ATP sintetasi agisce al contrario: idrolizza ATP e pompa protoni contro gradiente. Se la respirazione si arresta in presenza di ATP (proveniente dalla glicolisi) la ATPasi mitocondriale idrolizza l’ATP e pompa i protoni dalla matrice allo spazio intermembrana. Se la permeabilità della membrana interna rimane bassa, si ristabilisce una differenza di potenziale elettrochimico protonico. In queste condizioni basta l’idrolisi di poco ATP per mantenere la differenza di potenziale elettrochimico protonico necessaria al funzionamento mitocondriale.

Se la permeabilità di membrana invece aumenta (per esempio per l’apertura del poro di transizione della permeabilità o PTP) il mitocondrio non riesce a mantenere la differenza di potenziale elettrochimico protonico nonostante l’idrolisi di ATP, che diventa massimale. In questo senso l’apertura del poro precipita la crisi energetica perchè fa consumare più ATP. L’evento è rilevante per l’apoptosi perché se la cellula è carente di ATP esso viene utilizzato dalla ATP sintetasi e non ce n’è abbastanza per attivare l’apopotosoma: ciò fa abortire la risposta apoptotica e devia la morte cellulare verso la necrosi.

La natura molecolare del poro non è nota anche se ci sono molte ipotesi e qualcuno ha proposto che la ATP sintetasi abbia un ruolo. Diverse sostanze determinano l’apertura del PTP: calcio, acido arachidonico… Altre sostanze, come Bax o BCL-2, influenzano la sensibilità del poro rendendone l’apertura più facile o più difficoltosa.

Se la membrana interna non è più impermeabile perché si è aperto il poro il mitocondrio tende a rigonfiarsi per l’entrata di proteine diffusibili e acqua. Per gradi estremi questo rigonfiamento provoca la rottura della membrana esterna e la fuoriuscita del cit C e di SMAC. Il poro stesso può inoltre essere importante per il rilascio di proteine apoptogeniche dallo spazio intermembrana.

 Il fenomeno di rigonfiamento è prevenuto dalla ciclosporina A che desensibilizza i pori della transizione della  permeabilità (PTP).

L’apoptosi non è di esclusiva competenza delle caspasi ma altri enzimi possono essere attivati e provocare questo processo: calpaine, proteasi attivate dal calcio, catepsine.

Alcuni bersagli delle caspasi effettrici

·  PARP (poli adipil ribosio polimerasi): un enzima importante per la riparazione del DNA;

·  Lamina: è una proteina di membrana nucleare. Il suo taglio rende più accessibile il nucleo alle endonucleasi;

·  Flippasi;

·  Endonucleasi: vengono attivate dal clivaggio e la loro azione si esplica sul DNA, in particolare nelle sequenze tra i nucleosomi.

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