Sviluppo della colonna significa un processo attraverso il quale i campioni vengono separati Gli eluati:
• Man mano che il campione (eluato) fuoriesce, questo viene raccolto e analizzato,
• Oppure si raccolgono tutti gli eluati e si analizzano dopo,
Collettore di frazioni:
• Ha lo scopo di raccogliere un volume ben preciso degli eluati,
Rivelatore:
• Gli eluati vengono poi fatti passare nel rivelatore.
Rivelatori:
• Assorbimento della luce visibile o UV,
• Fluorescenza,
• Variazione dell’indice di rifrazione,
Il segnale generato dal rivelatore viene raccolto sulla carta di un registratore (cromatogramma ) dove ogni composto è identificato da un picco:
1. tempo di ritenzione (tr),
2. tempo morto ™,
3. tempo netto di ritenzione (tr’ = tr – tm ),
4. larghezza del picco (w),
5. volume di eluizione o ritenzione (Ve o Vr ).
il volume di ritenzione o eluizione e il tempo di ritenzione sono in relazione tra di loro tramite la velocità di flusso Fc:
Vr = tr x Fc
Fc dipende dalla dimensione della colonna e dalle caratteristiche fisiche delle particelle:
Vr = Vm (vol. vuoto) + Kd x Vs
L’area di ogni picco sarà proporzionale alla quantità di campione presente e quindi può essere utilizzata per un analisi quantitativa. Il buon esito di ogni procedura cromatografia viene valutata in base alla risoluzione del picco:
2 ( trB ─ trA )
Rs = ──────────────
WA + WB ( larghezza dei picchi )
Quanto più il valore del picco è elevato migliore sarà la separazione delle sostanze passate nella colonnina. Consideriamo un sistema ad un soluto (A) e due fasi immiscibili. Il componente A viene a distribuirsi fra fase stazionaria (s) e fase mobile (m).
• un elevato valore di Kd indica che il componente A preferisce la fase stazionaria e si muove lentamente attraverso la colonna,
• bassi valori di Kd indicano che il componente A ha poca affinità con la fase stazionaria e quindi si muove rapidamente,
• se per un analita Kd =1 , esso si distribuirà equamente tra fase stazionaria e fase mobile,
A causa delle velocità di migrazione diverse i componenti vengono a separarsi tra loro;
è opportuno scegliere le due fasi in modo che per gli analiti da separare i coefficienti di distribuzione siano i più differenti possibili. Infatti più è diverso il coefficiente di ripartizione di due sostanze più efficace sarà la loro ripartizione.
Esempio: 3 diverse specie molecolari con K diverse fra le due fasi (0.2, 1, 2 ) possono essere separate per cromatografia.
Dopo la separazione abbiamo l’utilizzo di:
• Raccoglitori di frazioni.
• Detector (rivelatori).
• Recorder (registratori).
