Per effettuare separazioni di miscele con questa metodica si sfruttano i principi di:
- cromatografia di adsorbimento,
- cromatografia di ripartizione,
- gel filtrazione,
- scambio ionico.
Cromatografia: fase stazionaria
La fase stazionaria é supportata su lastre di vetro, fogli di alluminio o di plastica resistente ai solventi usati per l’eluizione.
Fra i materiali più usati comunemente come fase stazionaria vi sono:
- gel di silice = per cromatografia di ripartizione i di absorbimento;
- allumina = per cromatografia di absorbimento;
- cellulosa = per cromatografia di ripartizione.
Preparazione delle lastrine
La preparazione delle lastrine viene effettuata mescolando gel di silice (o altro materiale) con acqua, in rapporto O,5 g/ml. Si agita energicamente la miscela aggiungendo eventualmente gesso (10-15%) per rendere più compatto lo strato e si applica, per mezzo di uno stratificatore, la miscela sulle lastre ben lavate (miscela cromica-acetone) ed asciugate.
Le piastre così preparate sono lasciate ad asciugare all’aria e successivamente attivate in stufa per 30′ circa a 120°C. Lo spessore della fase stazionaria sulle lastre sarà di 0,25 mm per scopi analitici, mentre per scopi preparativi lo spessore può variare da 1 a 2 mm.
Indicatore di fluorescenza
Insieme al gesso, alla fase stazionaria viene aggiunto un indicatore di fluorescenza costituito da:
• silicato di zinco attivato con manganese che assorbe a lunghezza d’onda 254 o 366 nm.
• indicatore di natura organica eccitabile a lunghezza d’onda 366 nm.
L’uso dell’indicatore di fluorescenza permette di localizzare sulla lastra le sostanze che assorbono alle lunghezze d’onda su indicate in quanto queste attenuano la fluorescenza sul punto della piastra dove si trovano.
Cromatografia: fase mobile
La fase mobile viene scelta in funzione delle sostanze da separare. In generale per sostanze poco polari si scelgono solventi non acquosi o miscele di essi. Nel caso di uso analitico le sostanze da esaminare vengono sciolte in un solvente e tramite un capillare si preleva una piccola parte di soluzione che viene caricata in un punto a circa un centimetro dal bordo inferiore della piastra.
Non appena il solvente è evaporato si pone la piastra dentro una “vaschetta” cromatografica all’interno della quale è posta la fase mobile. Chiusa la vaschetta satura dei vapori dell’eluente, per capillarità si ha il trascinamento delle varie sostanze che costituiscono la miscela
Camera cromatografica
La camera cromatografica (“vaschetta”) è costituita da un recipiente di vetro dotato di un coperchio smerigliato in corrispondenza dei bordi della camera allo scopo di assicurarne una buona tenuta.
Attorno ai lati della vasca si pone un foglio di carta da filtro che, impregnandosi dell’eluente usato, assicura la saturazione all’interno della vasca. Il livello dell’eluente posto al fondo della vasca sarà di circa un centimetro. E’ importante comunque che il livello dell’eluente sia al di sotto del punto di caricamento della piastra per evitare fenomeni di diffusione delle sostanze all’interno dell’eluente contenuto nella vaschetta.
La piastra viene tolta dalla vaschetta non appena il fronte del solvente é arrivato a circa un centimetro dal bordo superiore della piastra stessa, questa operazione viene definita “sviluppo”.
Nel caso invece di un uso preparativo le sostanze sciolte in un solvente vengono caricate a striscio su una linea ad un centimetro circa dal bordo inferiore della piastra preparativa con una pipetta Pasteur. Generalmente si usano lastre delle dimensioni di 20×20 cm e per il resto si opera come nel caso di una TLC analitica.
Per le separazioni di tipo analitico la quantità di soluzione che si deposita sulla piastra é di circa 1 o 2 µl corrispondente a qualche gamma (10-6 g) di miscela,se si vuole caricare una quantità misurata si usano delle micro pipette.
Per le separazioni di tipo preparativo la quantità di miscela che si può caricare varia in funzione di diversi parametri (quantità di fase stazionaria, eluente usato, differenza di Rf).
Le varie sostanze che si separano formeranno delle bande che verranno grattate meccanicamente. Ciascuna di queste verrà trattata successivamente con un solvente in grado di staccare dalla fase stazionaria la sostanza che si é separata. Dopo l’eluizione la piastra viene tolta dalla vaschetta, viene fatto evaporare il solvente e viene analizzata. Si possono verificare diversi casi:
(1) le sostanze separate sono colorate.
(2) le sostanze separate sono incolori, ma assorbono all’ U.V. (lunghezza d’onda 254 o 366 nm).
(3) le sostanze separate sono incolori e non assorbono all’ U.V.
Nel primo caso é facile potere valutare il numero dei componenti la miscela e nel caso di una TLC preparativa é facile recuperarli. Nel secondo caso l’uso di un indicatore di fluorescenza mescolato con la fase stazionaria ci permette con una semplice irradiazione alla lampada U.V. la localizzazione dei vari componenti. Nel caso di una TLC preparativa si possono evidenziare le varie bande corrispondenti alle varie sostanze e quindi recuperarle.
In questi primi due casi le sostanze non subiscono nessuna modificazione. Nel terzo caso si può evidenziare la presenza delle varie sostanze separate spruzzando la lastra con una soluzione contenente sostanze in grado di interagire chimicamente con i vari costituenti la miscela in modo da ottenere delle macchie visibili (si possono ottenere macchie variamente colorate in funzione della natura delle sostanze separate e dei rivelatori usati, nel caso in cui queste reazioni non si manifestino a temperatura ambiente occorre scaldare).
Nel caso di una TLC preparativa, ove una rivelazione distruttiva non avrebbe significato, si usa coprire parzialmente la lastra e spruzzarla con un rivelatore opportuno, così si evidenziano ai margini le sostanze separate a cui corrisponderanno delle bande.
Un metodo di carattere generale consiste nell’immergere dentro una vaschetta contenente cristalli di iodio la piastra cromatografica. Lo iodio allo stato di vapore si accumulerà nei punti in cui sono localizzati i vari composti dando luogo a delle macchie marroni su uno sfondo giallo.
Questo metodo usato per quelle sostanze che reagiscono reversibilmente con lo iodio permette il recupero delle sostanze stesse.
Questi metodi di rivelazione permettono di evidenziare macchie corrispondenti a 10-6 g di sostanza separata. Fra le proprietà caratteristiche della cromatografia c’è il fatto che, con un ben determinato sistema cromatografico, il movimento di ciascuna sostanza rispetto al fronte del solvente è una proprietà caratteristica della sostanza ed è riproducibile nelle stesse condizioni.
Nel caso della cromatografia su carta o su strato sottile lo spostamento viene espresso come Rf {rate flow }: rf: distanza percorsa dalla sostanza / distanza percorsa dall’eluente.
Ovviamente la sostanza che viene usata come standard deve essere dal punto di vista chimico strutturalmente simile alla sostanza di cui vogliamo ricavarci l’Rx. Per esempio nel caso degli zuccheri la sostanza presa come riferimento è il glucosio.
E’ possibile potere utilizzare la stessa lastrina TLC per analizzare una miscela di sostanze in due differenti sistemi eluenti. Questo si realizza con la cromatografia bidimensionale. In questo caso si carica la miscela in un angolo della lastrina cromatografica e si sviluppa con un tipo di eluente, successivamente si fa asciugare e si sviluppa in un nuovo tipo di eluente ponendo la lastrina a 90° rispetto alla eluizione precedente.
Un’altra tecnica utilizzata é la cosiddetta cromatografia radiale su carta o su TLC. Si può applicare sia per scopi analitici che per scopi preparativi e consiste nel caricare la miscela al centro di una lastra cromatografica facendo gocciolare in maniera costante il solvente sulla miscela. In questo modo le varie sostanze migreranno in direzione radiale. Nel caso di un uso preparativo la piastra viene fatta ruotare a velocità costante in modo tale da aumentare la velocità di eluizione.
