Il frazionamento conseguenza della centrifugazione
La centrifugazione è una tecnica separativa basata sulle differenze di densità e dimensioni tra le particelle presenti in una miscela. L’equazione fondamentale che descrive la velocità di sedimentazione di una particella in sospensione. Esiste un’ equazione che spiega la velocità limite della particella dipende essenzialmente dalle dimensioni e dalla densità della particella stessa. Quindi, generalmente, particelle più grandi e più dense si muoveranno più rapidamente e raggiungeranno prima il fondo di un tubo da centrifuga.
Poiché gli organelli in un omogenato cellulare hanno dimensioni, densità e forme diverse, sarà possibile separarli in base alla loro diversa velocità di sedimentazione. Questo tipo di separazione è consueto quando si vogliano studiare gli organelli isolati – è mediante questo tipo di separazione che si stabilì che i mitocondri sono responsabili dell’intero ciclo di Krebs e che i ribosomi sono responsabili della sintesi proteica.
Ricercare nel frazionamento
È possibile verificare l’identità e la purezza degli organelli isolati mediante le tecniche centrifugative descritte ricercando nelle diverse frazioni ottenute la presenza di composti od enzimi presenti selettivamente in determinati compartimenti cellulari. Naturalmente, l’assunzione è che la localizzazione subcellulare di questi enzimi sia rigidamente predeterminata. Siccome questo è solo approssimativamente vero, è generalmente utile seguire la purificazione degli organelli utilizzando più di un marker.
Come valutare l’andamento di una purificazione
In genere, per valutare l’andamento di una purificazione (di un organello, o anche solo di un enzima) è utile valutare il rapporto tra l’attività enzimatica di una data frazione ed il contenuto di proteina totale.
