Per clonaggio si intende creare ‘copie identiche’ (= CLONI) di un frammento di DNA che possono essere sfruttate per sintetizzare artificialmente delle proteine (insulina, aldosterone etc.).
Frammento di DNA
Il frammento di DNA da clonare viene isolato e tagliato con un opportuno enzima di restrizione.
Il gene isolato viene inserito in un vettore di clonaggio, cioè una molecola di DNA naturale o artificiale:
- un plasmide,
- un cosmide
nel caso di clonaggio di un frammento più grande:
- un BAC (cromosoma artificiale batterico),
- un PAC (cromosoma artificiale plasmidico),
- uno YAC (cromosoma artificiale di lievito).
Questi vettori si diversificano principalmente in base alle dimensioni del frammento da clonare:
- Plasmidi: 0.1 – 10Kb
- Fagi: 8 – 22 Kb.
- Cosmidi: 32 – 45 Kb.
- BAC e PAC: 75 – 300 Kb.
- YAC: 100 – 2000 Kb.
Vettore di clonaggio
Un vettore di clonaggio deve avere determinate caratteristiche:
- siti unici di restrizione vicini o all’interno di marker genetici la cui espressione viene alterata all’inserzione di DNA estraneo;
- un’origine di replicazione “ori” a partire dalla quale si replica tutta la molecola di DNA (sia quella inserita sia quella del vettore) all’interno della cellula ospite;
- un marcatore (generalmente un fattore di resistenza ad un antibiotico, come l’ampicillina) che consente successivamente la selezione, su opportuni terreni di crescita, del le cellule che hanno acquisito il frammento.
Il vettore di clonaggio deve essere digerito con lo stesso enzima utilizzato per il frammento di DNA da clonare (in modo da produrre delle estremità complementari). L’inserzione del frammento nel vettore avviene mediante gli enzimi topoisomerasi e ligasi producendo un “vettore ricombinante” o “molecola chimerica”.
Clonaggio di un gene
Per clonare un gene dobbiamo quindi inserirlo in un vettore di clonaggio ed introdurre il “costrutto” risultante in un ospite capace di replicarlo. Le cellule ospiti nelle quali si inserisce il vettore ricombinante sono cellule batteriche , batteriofagi o fagi e vengono trasformate per consentire l’assorbimento del vettore:
Queste cellule vengono poi coltivate su opportuni terreni selettivi al fine di selezionare solo quel le contenenti il costrutto. Per costruire le banche genomiche si usa un approccio del tutto simile, solo che il taglio non è limitato ad un gene, ma viene esteso a tutto il genoma. Il “Progetto Genoma” è stato realizzato in parte proprio con questa tecnica.
Clonaggio del DNA
In Biologia, clonare un organismo significa ottenere da un individuo una popolazione di organismi geneticamente identici; in Biologia Molecolare clonare un tratto di DNA significa ottenere un insieme di molecole di DNA identiche a quelle di partenza. Ciò ha dato il via alla tecnologia del DNA ricombinante.
Il clonaggio del DNA può essere raggiunto attraverso due tecniche:
- una in vivo, basata sulle cellule (E. coli);
- una in vitro, chiamata PCR o reazione a catena della polimerasi. Nell’approccio basato su cellule è richiesto un vettore per portare il frammento di DNA d’interesse nella cellula ospite; il vettore può essere un plasmide o un virus.
Clonaggio tramite vettori
Un vettore è un agente che può portare un frammento di DNA in una cellula ospite; se usato per la riproduzione di frammenti di DNA è chiamato vettore di clonaggio, se è usato per l’espressione di geni contenuti nel DNA inserito viene chiamato vettore di espressione, i vettori di espressione contengono un promotore.
Vettore YAC
I vettori usati più comunemente includono plasmidi, fago lambda, cosmidi e il cromosoma artificiale del lievito (YAC).
