La diagnosi di certezza di Leishmaniosi si ottiene normalmente con l’osservazione diretta di Leishmania infantum al microscopio ottico, utilizzando materiale proveniente da biopsia linfonodale o sternomielocentesi, strisciato su vetrini e colorato con Giemsa, ma in alcuni casi è possibile non ritrovare il parassita anche se il soggetto è infetto. Inoltre l’identificazione di Leishmania spp. da coltura (in terreno di Tobie Evans) richiede molto tempo.
Con le prove sierologiche (IF) non è sempre possibile una diagnosi certa, soprattutto nelle zone in cui la Leishmaniosi ha carattere endemico, in quanto animali sani possono risultare sieropositivi e animali infetti possono risultare sieronegativi o comunque presentare titoli anticorpali troppo bassi perché siano individuati dal test.
Negli ultimi anni sono stati messi a punto protocolli diagnostici basati sulla PCR, con valori di sensibilità/specificità pari al 100%. Questi risultati sono certamente migliori di quelli ottenibili con le prove sierologiche, con l’osservazione microscopica e con le prove colturali.
La diagnosi di Toxoplasmosi e di Neosporosi si effettua con esami istologici, con metodi immunoistochimici, con prove biologiche e con prove immunologiche (dyetest, FdC, IFI, ELISA, IHA per la Toxoplasmosi, ELISA per la Neosporosi).
Si tratta di metodiche che non sempre permettono di effettuare diagnosi di certezza: i campioni biologici vanno spesso incontro a rapida autolisi, l’immunoistochimica e le prove biologiche richiedono troppo tempo, i titoli anticorpali possono rimanere a lungo tempo elevati e, a fronte di una elevata specificità la sensibilità può essere modesta. Per la sua importanza come agente zoonosico, negli ultimi anni l’attenzione dei ricercatori si è rivolta soprattutto a Toxoplasma gondii: per la diagnosi di Toxoplasmosi nell’uomo sono state allestite reazioni di PCR i cui risultati vanno sempre messi in correlazione con i dati clinici, sierologici ed, eventualmente, immunoistochimici in quanto la positività potrebbe essere correlabile ad uno stato di premunizione per infezioni pregresse. In medicina veterinaria T. gondii, come causa di aborto nei piccoli ruminanti, è stato studiato tramite nested-PCR e reazioni di PCR in grado di individuare il protozoo nel cervello, nella placenta e nei cotiledoni dei feti abortiti. Con la PCR è possibile anche individuare T. gondii in campioni biologici di cani e gatti: umore acqueo, liquido cerebrospinale, sangue. Anche la diagnosi di Neosporosi può essere conseguita mediante la PCR.
Inoltre, poiché T. gondii e Neospora caninum non sono ben distinguibili morfologicamente e vi può essere cross -reattività all’esame sierologico, la PCR che consente di ricercare entrambi i protozoi contemporaneamente distinguendoli. La diagnosi di Babesiosi e Theileriosi si consegue con l’osservazione al microscopio ottico di strisci di sangue (Babesia ) o di biopsie linfonodali (Theileria ), colorati con il metodo di Giemsa e MayGrunwald-Giemsa.
Tuttavia, la diagnosi di certezza e l’identificazione della specie parassitaria responsabile possono presentare notevoli difficoltà; ad esempio gli animali che superano la fase acuta divengono portatori asintomatici di un numero molto scarso di parassiti che non è possibile individuare con l’osservazione microscopica. L’attenzione della comunità scientifica si è rivolta soprattutto alla Babesiosi dei bovini (le specie più importanti sono B. bovis e B. bigemina) e degli equini (B. equi e B. caballi) e alla Theileriosi dei bovini (le specie più importanti sono T. annulata e T. parva).
Sono state messe a punto reazioni di multiplex-PC R in grado di individuare contemporaneamente B. bovis, B. bigemina e Anaplasma marginale , diagnosi che può essere perfezionata dall’applicazione del dot-blot. Reazioni di PCR sono utilizzabili per la diagnosi delle infezioni sostenute da T. annulata, da T. parva e da entrambe le specie. E’ stata disegnata una sonda B. bovis-specifica in grado di individuare il protozoo nel sangue intero con sensibilità molto alta; sono state disegnate sonde specifiche per l’identificazione contemporanea di sei specie di The ileria mentre è stata messa a punto una RLB in grado di esaminare molti campioni per individuare contemporaneamente tutte le specie di Babesia e Theileria dei bovini. Per quanto riguarda la Babesiosi degli equini, in molti Paesi Europei, il test ufficiale è la FdC, caratterizzata però da bassa sensibilità.
La PCR è in grado di individuare i cavalli infetti che risultano negativi ai test sierologici. La diagnosi di Criptosporidiosi si effettua tramite l’osservazione (a forte ingrandimento) al microscopio ottico di strisci fecali colorati con il metodo di Machiavello, di Ziehl-Neelsen o di Giemsa ovvero con la sedimentazione, previa concentrazione con soluzione di Telemann. Sono utilizzabili anche l’ELISA e l’IF, che però non consentono l’identificazione di specie. Con l’osservazione diretta si può formulare diagnosi di certezza solo nei casi di infezioni acute, in cui si ritrovano numerose oocisti o sporocisti, fino a 500.000/gr. Anche l’ELISA e l’IF sono attendibili solo se effettuate con infezione acuta in atto. La PCR presenta sensibilità molto elevata (fino a – 8090 forme cistiche/gr.), permettendo quindi di individuare anche i soggetti eliminatori asintomatici. L’applicazione della PCR nella diagnosi delle infezioni da Cryptosporidium è molto importante anche in medicina umana per le implicazioni di questa patologia come zoonosi: sono state, infatti, messe a punto PCR in grado di differenziare gli stipiti umani e animali di Cryptosporidium parvum e Cryptosporidium da Cyclospora, che sono protozoi con diversa sensibilità ai farmaci.
La diagnosi di Giardiosi si può conseguire con l’osservazione diretta al microscopio di strisci di materiale fecale o di campioni arricchiti con 4 ZnSO, colorati con liquido di Lugol. A causa dell’eliminazione irregolare di cisti è però necessario effettuare la ricerca nelle feci per tre gg. consecutivi (infatti un solo esame può permettere di individuare solo il 50% dei campioni positivi). E’ stato inoltre dimostrato che l’IF e l’ELISA, test spesso utilizzati, possono dare risultati falsi negativi (bassa sensibilità) e falsi positivi (bassa specificità).
La PCR è in grado di individuare ed amplificare tratti di DNA Giardia – specifici, distinguendo anche ceppi patogeni ed apatogeni e cisti vitali e non vitali. La ricerca di cisti e trofozoiti di Entamoeba hystolitica è possibile sia con l’osservazione al microscopio di strisci fecali colorati con – Fe ematossilina sia con esami colturali. Per la diagnosi possono essere utilizzate anche l’ELISA e la FdC. La PCR è in grado di individuare E. hystolitica distinguendo anche in questo caso ceppi patogeni da ceppi a-patogeni.
La diagnosi di Coccidiosi aviare si consegue con l’esame microscopico delle feci, per evidenziare le oocisti o con l’esame del raschiato della mucosa intestinale, per individuare gli schizonti. Per le differenze patogenetiche che caratterizzano le diverse specie di coccidi, é spesso necessario ottenere l’identificazione di specie e non sempre le differenze morfologiche (forma e dimensioni), sono ben individuabili.
E’ possibile utilizzare la RAPD, dotata di elevata sensibilità e specificità, in grado di rilevare e differenziare otto specie di Eimeria dei polli.
