Tutto è partito dalla produzione di una libreria di mutanti random prodotta utilizzando un trasposone.
Per produrla si usano trasposoni della famiglia TN10.
In un plasmide è presente questo trasposone che ha sequenze "IS" al 3' ed al 5', al suo interno c'è una cassetta che codifica per una proteina che da resistenza alla spectinomicina.
Il TN10 è modificato perchè i lgene trasposasi che normalmente è interno alla sequenza si trova all'esterno del trasposone.
Tutto è partito dalla produzione di una libreria di mutanti random prodotta utilizzando un trasposone.
Per produrla si usano trasposoni della famiglia TN10.
In un plasmide è presente questo trasposone che ha sequenze "IS" al 3' ed al 5', al suo interno c'è una cassetta che codifica per una proteina che da resistenza alla spectinomicina.
Il TN10 è modificato perchè i lgene trasposasi che normalmente è interno alla sequenza si trova all'esterno del trasposone.
Sul plasmide presente anche:
• il gene per la resistenza all'eritromicina
• 2 porzioni contenenti l'origine di replicazione per i gram –
• ORIts che permette al plasmide di replicarsi nei gram + ,si chiama ts perchè è termosensibile cioè attiva o inattiva in relazione alla temperatura di crescita dei batteri che lo contengono. In questo caso sopra i 37° non si replica mentre sotto i 37 ° si replcia (solo per i gram +).
Un'altra cosa è che si conosce la sequenza del trasposone permettendoci di creare primer che legano in modo specifico porzioni terminali del trasposone.
Usato per infilarlo in bacillus cereus tramite elettroporazione.
Come si sono selezionati i trasformanti?
Si è coltivato su spectinomicina ed eritromicina, chi riesce a crescere ha acquisito i lplasmide.
Poi in brodo si è creato un pool delle colonie cresciute i nterreno solido.
Incubato a temperatura permissiva per l'origine di replicazione (ORIts) cioè a 32° per u ntempo necessario affinchè si producesse la trasposasi.
La trasposasi stacca i ltrasposone dal plasmide e lo infila in modo random nel batterio.
Come si stacca?
La trasposasi si lega alla prozione "IS" del trasposone, forma un loop, taglia il trasposone e lo infila nel genoma del batterio.
Processo di cura dal plasmide.
Il plasmide è ancora all'interno delle cellule e la mutazione genomica avvenuta è instabile e può ristaccare il trasposone dal genoma e integrarlo in altri punti.
Per togliere il plasmide basta spostarci a 42° così da bloccare l'origine di replicazione.
La cellula batterica per divisione diluirà i lplasmide (perchè il plasmide non si replcia più, l'altro metodo sarebbe l'elettroporazione ma troppo stressante per le cellule).
Lo shift a 42° non è così efficiente perchè ho ancora un po' di cellule con palsmide (efficienza della cura 60%).
Allora risemino la coltura su terreni solidi, faccio u ncontrollo della presenza o assenza del plasmide, separando sepratamente in terreni con spectinomicina ed eritromicina in doppia copia.
Successivamente elimino tutte quelle colonie che contengono resistenza all'eritromicina.
Creata la collezione di mutanti posso valutare vari aspetti.
In questo caso si è andati a valutare la morfologia della colonia:
• Wild type: colonia molto compatta, le cellule formano cordoni che danno un margine frastagliato alla colonia.
• Mutante MS5006+: colonia non compatta per la rpesenza di porzioni di lisi cellulare.
Poi sono andati ad analizzare quale parte del genoma è mutata con l'inserzione del trasposone.
Questo è stato visto usando un primer ed ottenendo la porzione destra e sinistra del trasposone, controllando se è all'interno di gene o regione regolatoria (per esempio un promotore).
Le sequenze sono poi state analizzate tramite l'uso di una banca dati.
E' stato inserito un gene che codifica per la proteina "ribG".
Questo gene fa parte di un operone che codifica per diversi enzimi della via metabolica che sintetizza la riboflavina.
Questa via metabolica è diversa a seconda del microrganismo (per esempio lieviti diverso dai bateri).
La riboflavina è la viamina B2 che fa parte del complesso B.
Sono composti essenziali infatti l'uomo e gli animali non riescono a produrla solo funghi, lieviti e batteri.
E' stato controllato se il mutante era auxotrofo per la vitamina B2.
Per fare questo è stato usato un terreno senza vitamina B2 sul quale è stato seminato in modo uniforme una sospensione del mutante.
Le piastre sono in doppio:
1. una senza vitamina B2
2. una con dischetti imbevuti a concentrazioni note di vitamina B2
Dove non c'era la vitamina B2 non cresceva, era auxotrofo.
Cresceva solo dove erano presenti i dischetti.
Alla'umentare della concentrazione della vitamina B2 aumentava anche l'alone di crescita.
nel caso di prima c'erano placche di lisi perchè la concentrazione della vitamina B2 era bassa.
Poi è stata eseguita un'analisi quantitativa.
Attorno ad un inoculo puntiforme si sono messi 6 dischetti a diverse concentrazioni ed a distanze diverse.
Si è osservato poi a che concentrazione di vitamina B2 ed a che distanza il mutante cresceva.
Quest'analisi è usata per valutare la capacità di altri batteri di secernere la vitamina B2 così da valutare se nell'enterogermina i batteri che ci sono sono probiotici.
Non tutti i batteri producono la vitamina B2 mentre i lieviti ed i funghi sì.
Se non possono produrla devono assorbirla dal mezzo ed immagina il problema se assimilassero la vitamina B2 dal nostro itnestino, per questo và controllato se sono realmente probiotici.
è stato allestita una coltura con il mutante e degli altri ceppi con l'inoculo dei vari tipi di enterogermina.
In questo caso non ci sono i dischetti ma il mutante.
Se il mio mutante non cresce vuol dire che il ceppo non secerne vitamina B2.
Magari non è che non la produce proprio ma ne produce così poca che non basta per far crescere il nostro mutante.
Poi si è fatta un'altra prova allontanando il punto di inoculo dei ceppi da studiare rispetto alla posizione del nostro mutante (centrale), naturalmente si è inoculato solo quelli che dall'esperimento precedente davano segno di produzione di vitamina B2, in questo modo posso confrontare l'efficienza di produzione dei vari mutanti.
