Ciascuna posizione del vetrino è occupata da una proteina.
1. Le proteine native sono spottate sul vetrino
2. Aggiungo una proteina X
3. spottate proteine native + alcune proteine legate alla proteina X
La proteina X è semrpe marcata con un fluorocromo o rilevabile tramite test della fosfatasi.
Della proteina X conosco la sequenza ma non la sua funzione, in questo modo posso scoprilo.
Ciascuna posizione del vetrino è occupata da una proteina.
1. Le proteine native sono spottate sul vetrino
2. Aggiungo una proteina X
3. spottate proteine native + alcune proteine legate alla proteina X
La proteina X è semrpe marcata con un fluorocromo o rilevabile tramite test della fosfatasi.
Della proteina X conosco la sequenza ma non la sua funzione, in questo modo posso scoprilo.
Come si immobilizzano all'inizio le proteine?
• Clonaggio delle proteine in E.Coli
• Purificazione
• Legarle sul vetrino.
Ma facciamo finta che vogliamo farlo in casa:
• Pcr
• clonaggio
• purificazione
• impiego di un anticorpo monoclonale
Come posiziono le proteine?
Conoscendo la sequenza amplifichiamo il gene della proteina utilizzando primer modificati (aggiungendo il promotore).
L'altro primer invece conterrà una tag che inserirà durante la PCR.
Ciascun frammento amplificato avrà la sequenza della proteina che mi interessa , il promotore ed il tag.
Traduco la sequenza ottenendo una proteina nativa con aggiunto il tag (uguale per tutte le proteine e che mi permetterà di legarle sul vetrino).
Essendo unico uso un solo anticorpo monoclonale per tutte che m iriconosce il tag.
L'anticorpo ha una semplice funzione d'ancora ed a differenza del detection array l'anticorpo è uguale per tutti.
Le proteine le posso legare anche direttamente sul substrato.
Esempio pratico.
Francisella tularensis (agente bioterroristico di classe A).
E' un patogeno del quale si conosce pochissimo si usa questa tecnica per vedere quali sono gli antigeni immunogeni dell'ospite.
Questo patogeno dà la tularemia, bastano pochissime CFU per contagiare.
Altro esempio.
Helicobacter pylori (coinvolto nel carcinoma gastrico).
Trasmissione per via orofecale.
La tecnica è stata usata per vedere quali proteine venivano espresse durante la carcinogenesi.
Si sono confrontati pazienti con helicobacter senza il cancro con quelli che invece avevano helicobacter ed il cancro, per vedere le proteine espresse.
E poi sceglievano una di queste proteine per fare il functional array.
In alcuni casi, alcuni tipi di array possono consentirci di recuperare la proteina legata per poterla studiare.
La tecnica per staccarla si chiama "SELDI".
