la Sterilizzazione è il processo attraverso il quale tutte le forme vitali dei microrganismi sono rimosse o distrutte. È l’eliminazione di tutti i microorganismi presenti in un oggetto o in una preparazione farmaceutica. Con un processo di sterilizzazione si deve raggiungere una probabilità inferiore ad una su un milione di trovare una unità non sterile. Ciò equivale a definire un SAL (Sterility Assurance Level) uguale o minore di 10-6.
Fattore di inattivazione = popolazione microbica iniziale
popolazione microbica finale
Grado di sterilità = fattore di inattivazione
grado medio di contaminazione iniziale
I fattori che influenzano l’efficacia di un processo di sterilizzazione sono: il numero dei microrganismi sopravvissuti in una data popolazione microbica ed il tempo di esposizione al mezzo sterilizzante o alla potenza della radiazione usata; il tempo, o la potenza, richiesto per ridurre la concentrazione di microrganismi ad un prestabilito valore e la concentrazione microbica iniziale.
L’espressione matematica che rappresenta queste relazioni è:
Nt = N0 10 –t/D
Cinetica di un processo di sterilizzazione: Immaginiamo di immergere in vapore saturo in pressione alla temperatura costante di 121°C un sistema inquinato da una specie microbiologica pura ed omogenea, ad esempio una fiala contenente una sospensione acquosa di un microrganismo spirogeno. È sperimentalmente dimostrato che la reazione di degradazione termica del microrganismo in questione segue le leggi delle reazioni chimiche. Detto N il numero di microrganismi presenti nel sistema ad un certo istante, la variazione di tale numero in funzione del tempo t di esposizione alla temperatura di sterilizzazione prescelta puo’ essere scritta:
dN/dt = -KN
K = costante della specie e delle condizioni del microrganismo scelto.
La reazione di degradazione, la sterilizzazione, si sviluppa come reazione chimica di I ordine (simile a una reazione di decomposizione chimica) in cui la velocità è proporzionale in ogni istante solo alla quantità di prodotto da degradare (o decomporre).
Nella sterilizzazione in corrente di vapore anche le stesse molecole di vapore partecipano alla reazione; si ha quindi una reazione bimolecolare:
dN/N = -K dt dN/N = -k dt
logN = -Kt + costante k = K/2,303
Al tempo zero si avrà:
t = 0 N = N0 quindi logN0 = costante
logN = -kt + logN0
N/N0 = 10-kt
N0 = numero iniziale di microrganismi.
N = numero di microrganismi al tempo t.
t = tempo di reazione della sterilizzazione a vapore.
k = costante di velocità della reazione.
La velocità di sterilizzazione può essere espressa mediante il tempo di decadimento decimale (D): tempo necessario per ottenere, ad una specifica temperatura, la riduzione ad un decimo del numero dei microrganismi presenti nell’unità.
D varia con il tipo di microorganismo, il mezzo nel quale è immerso e la T di sterilizzazione; alla T di 121 °C, D è compreso tra 0.5 e 2 min; per i microrganismi più comuni D = 1min. Alla fine di ogni minuto di mantenimento a 121 °C il numero di microrganismi diminuisce di un logaritmo.
Metodi di inattivazione:
Fisici:
ñ Filtrazione: La filtrazione è un metodo di sterilizzazione in quanto rimuove da un fluido (aria o liquido) i microorganismi anche se non ne provoca la distruzione. Presenta il vantaggio di poter essere utilizzata per le soluzioni che contengono prodotti instabili ad altri processi di sterilizzazione.
ñ Calore umido: Il vapore condensando perde una considerevole quantità di calorie a temperatura costante. 1 Kg di vapore saturo condensato a 121° C perde 525 Kcal. La temperatura e la pressione corrispondente del vapore saturo sono strettamente correlati: il vapore saturo a 121° C ha una pressione di 2.05 bar.
Una mole di acqua (18 g corrispondenti a 18 ml allo stato liquido) allo stato di vapore occupa un volume di 15 l per cui il materiale da sterilizzare viene facilmente raggiunto dal vapore; la elevata riduzione in volume in seguito a condensazione permette una facile rimozione del condensato. L’inattivazione dei microorganismi avviene per coagulazione delle proteine cellulari quando il vapore entra in contatto direttamente o indirettamente con il microorganismo. Si usa per prodotti non-termolabili, che resistono alle condizioni di temperatura e umidità; quindi materiali solidi (abiti, strumenti in acciaio, vetreria); liquidi acquosi in contenitori chiusi (bottiglie e fiale); sistemi filtranti e reattori.
ñ Calore secco: Il calore secco è meno efficiente dal punto di vista della capacità di trasferimento del calore rispetto al calore umido (vapore saturo). Il calore secco può essere utilizzato per: annullare la capacità dei microorganismi di riprodursi e moltiplicarsi (sterilizzazione); distruzione dei prodotti derivati dai microorganismi: pirogeni ed endotossine (depirogenizzazione). Il Meccanismo si basa sull’ossidazione del materiale proteico del microorganismo.
Per la sterilizzazione si opera a 160°C da 120 a 180 minuti; a 170°C da 90 a 120 minuti; a 180°C da 45 a 60 minuti. Per la depirogenazione si opera a 230°C da 60 a 90 minuti oppure a 250°C da 30 a 60 minuti. Questo metodo si usa per oggetti di vetro e metallo; prodotti chimici, polveri ed oli anidri non termolabili. Si usano le stufe.
ñ Radiazioni: Le tecniche di sterilizzazione per irraggiamento possono far uso di: radiazioni elettromagnetiche (raggi ultravioletti, raggi gamma, raggi-X) radiazioni particellari (raggi-beta). Tra i vantaggi si hanno: alta affidabilità; assenza di residui nei prodotti sottoposti al processo; assenza di quarantene nei prodotti sottoposti a questo tipo di sterilizzazione; possibilità di sterilizzare il materiale nel contenitore finale chiuso; efficacia del processo legata ad un solo parametro che è la dose assorbita.
◦ Radiazioni ionizzanti: La radiazione ionizzante è direttamente responsabile del danno a livello del DNA cellulare; allo stesso tempo il passaggio delle radiazioni ionizzanti attraverso l’acqua causa ionizzazione e la formazione di radicali liberi e perossidi, altamente reattivi e distruttivi nei confronti della cellula; si ha quindi la distruzione dei microorganismi per inattivazione delle loro capacità riproduttive.
▪ Raggi UV – sono emessi da lampade a vapori di Hg. Hanno una capacità sterilizzante a corta e una lunghezza d’onda prevalente di 254 nm; limitato potere penetrante. L’intensità minima raccomandata per distruggere i microorganismi è 20mWsec/cm2. La tollerabilità di esposizione nell’uomo è 2.4 mW/cm2 per 1 ora. Si usa per sterilizzare AMBIENTI (aria); LIQUIDI in dipendenza della natura del liquido, della capacità di trasmettere la radiazione UV a 254 nm, dell’assenza di particelle in sospensione in grado di schermare i microorganismi; superfici di materiali (metalliche) lisce e prive di zone d’ombra. Sono solitamente usate per mantenere la sterilità dell’acqua durante la fase di stoccaggio.
Non si usano per vetro e plastica.
▪ Raggi gamma – radiazioni fotoniche emesse dal decadimento del nucleo da uno stato eccitato allo stato fondamentale (es. la cattura di neutroni termici da parte di 59Co porta alla formazione di 60Co. I fotoni emessi nel decadimento di 60Co hanno energie pari a 1.17 e 1.33 Mev). Esposizione di 48 ore per distruggere anche spore. Es: inserti.
▪ Raggi beta – sono particelle aventi carica negativa e la stessa massa di un elettrone; derivano dalla disintegrazione di elementi radioattivi, generate da acceleratori di elettroni; sono mediamente penetranti. Hanno una elevata energia cinetica e sono generati da acceleratori di elettroni. Gli elettroni emessi da un catodo sono iniettati in una cavità e accelerati mediante un campo elettrostatico (acceleratori elettrostatici) o un campo elettrico a radiofrequenza (acceleratori lineari). Applicazioni: materiale chirurgico, antibiotici, vaccini, ormoni, enzimi, vitamine.
Unità di radioattività.
Unità di dose assorbita GRAY (1 J/Kg) anche il rad è ancora usato:
1Gy = 100 RADS
dosi di 20-25 KGy. 2–2.5 Megarads assicurano la sterilità.
Chimici:
ñ Gas, Molti sono i gas (costosi) con proprietà germicida che possono essere utilizzati: ossido di etilene; formaldeide; b-propiolattone; perossido di idrogeno; ozono.
◦Ossido di etilene – l’ossido di etilene produce un’azione sterilizzante in seguito ad un’azione alchilante. La reazione e’ attivata da vari fattori, quali: presenza di vapore acqueo (60% di umidità relativa); aumento di temperatura (2.5 volte per ogni grado di aumento della temperatura generalmente eseguita a 40-60 °C); aumento della concentrazione di gas (400 – 1200 mg/l).
Il tempo di trattamento è di 6-24 ore. Penetra facilmente attraverso i contenitori plastici ma una elevata quantità di gas rimane adsorbito sulla superficie dei contenitori. Ha quindi una elevata tossicità, infiammabilità ed è facilmente esplosivo. La procedura si effettua in autoclave (in quanto contenitore sigillato). Dopo la sterilizzaizone il prodotto deve essere messo in quarantena e si deve effettuare la corretta eliminazione del gas dalla camera.
ñ Prodotti sterilizzanti
Controllo della sterilità
ñ Semina diretta, Si trasferisce la quantità di preparazione da esaminare direttamente nel terreno di coltura appropriato in in modo che il volume del prodotto non sia più del 10% del volume del terreno di coltura (salvo diverse indicazioni); si lascia incubare il terreno di coltura inoculato per almeno 14 giorni; si osservano le colture più volte durante il periodo di incubazione.
ñ Filtrazione su membrana, Filtrare con filtri da 0.45 μm in condizioni di asepsi; trasferire l’intera membrana nel terreno di coltura appropriato in appropriato volume; incubare per almeno 14 giorni.
ñ Saggio di convalida, Inoculare delle porzioni di terreno fluido al tioglicolato con un piccolo numero di microrganismi (10-100UFC) sia con i batteri aerobici che anaerobici indicati in tabella. Per il terreno di dirolizzato di soia e caseina usare i funghi.
