Il sequenziamento del DNA consiste in una reazione di PCR modificata in cui viene inserito un reagente in più, cioè una miscela di 4 terminatori marcati con quattro diversi fluorocromi e il cui template è rappresentato dal prodotto di PCR purificato. Un terminatore è un – dideossi -nucleotide (ddNTP), cioè un nucleotide con un atomo […]
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La metodica classica di estrazione del DNA da campioni biologici è l’estrazione fenolica. Come avviene l’estrazione di acidi nucleici Si deve preventivamente ottenere la lisi cellulare del campione mediante frantumazione manuale oppure tramite trattamento con il freddo; si utilizzano solventi chimici (SDS, Urea, Mercaptoetanolo, Proteinasi K) al fine di degradare lipidi e proteine. Dopo alcuni […]
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La localizzazione delle proteine da purificare influenza le metodiche che possono essere impiegate per ottenere un estratto grezzo di partenza. Per le proteine solubili extracellulari, cioè secrete in fluidi extracellulari (brodo di coltura nel caso di microrganismi; oppure fluidi biologici quali sangue, latte, urina etc.) in genere basta concentrare il liquido, perché la quantità di proteine […]
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Crescita della coltura batterica, Preparare il liquido LB medium. Luria-Bertani Medium è un ricco brodo per la crescita di E. coli costituito da : • Triptone 10g, • Estratto di lievito 5g, • NaCl 10 g. Addizionare a 950 ml di H2O deionizzata. Al brodo liquido si aggiunge per ogni litro, 15 g di Agar per […]