Blotting
esistono diverse tipologie di blotting:
Western Blotting: Le proteine separate in elettroforesi (SDS-PAGE) possono essere trasferite su un foglio di nitrocellulosa.
Il trasferimento, di solito, si effettua per elettroblotting:
il gel e la nitrocellulosa vengono posti in un apposito supporto a forma di sandwich immerso in un tampone nel quale ci sono due elettrodi paralleli. La corrente trasferisce le proteine dal gel sul foglio di nitrocellulosa.
Il foglio viene quindi saturato con siero di latte in polvere privo di grassi al 10% per bloccare i legami aspecifici e, poi, sottoposto a reazione con anticorpi. L’anticorpo primario è diretto contro la proteina di interesse; il secondario è diretto contro le IgG dell’organismo usato per produrre l’anticorpo primario.
Gli anticorpi secondari sono opportunamente marcati in modo da poter essere rivelati una volta legato l’anticorpo primario (in genere sono coniugati ad un enzima come ad esempio la perossidasi). Il blot viene quindi incubato con una soluzione contenente il substrato dell’enzima che viene convertito in un prodotto colorato.
La presenza di bande colorate sulla nitrocellulosa indica la presenza della proteina di interesse. Un metodo alternativo e più sensibile sfrutta il luminolo (un substrato chemiluminescente) la perossidasi ossida il luminolo con produzione di luce, la luce emessa può essere rivelata esponendo il blot a una lastra fotografica.
Southern Blotting: Tecnica per la rivelazione di specifici frammenti di DNA in una complessa mistura. Il DNA da analizzare viene digerito con enzimi di restrizione e poi separato mediante elettroforesi su gel di agarosio.
I frammenti di DNA nel gel vengono denaturati con soluzione alcalina e trasferiti su un filtro di nitrocellulosa o una membrana di nylon tamponando, preservando la distribuzione dei frammenti di DNA nel gel. Il filtro di nitrocellulosa viene incubato con una sonda specifica. La posizione dei frammenti di DNA che si ibrida con la sonda possono essere visualizzati mediante autoradiografia.
