Partiamo dagli albori.
Un iter diagnostico convenzionale come procede?
• Arriva un campione in laboratorio: polimicrobico (come le feci, tampone vaginale o orale) o monomicrobico (come il sangue, il liquor, le urine se prelevate con puntura sovrapubica così da non entrare in contatto con la flora genitale o un campione respiratorio prelevato con un broncolavaggio alveolare così da non contattare la flora batterica della cavità orale).
Partiamo dagli albori.
Un iter diagnostico convenzionale come procede?
• Arriva un campione in laboratorio: polimicrobico (come le feci, tampone vaginale o orale) o monomicrobico (come il sangue, il liquor, le urine se prelevate con puntura sovrapubica così da non entrare in contatto con la flora genitale o un campione respiratorio prelevato con un broncolavaggio alveolare così da non contattare la flora batterica della cavità orale).
• Un esame microscopio diretto: per valutare a seconda del campione che gli arriva per esempio se è liquor forse caso di sospetta meningite si valuta se ci sono batteri (me li aspetto nel polimicrobico facendo colorazione gram lo vedo) ma non nel liquor o se li trovo ne troverò un tipo solo perchè campione monomicrobico, e chiamerò il medico così intanto il paziente verrà trattato con un antibiotico. Se invece è polimicrobico posso orientarmi verso un tipo di microrganismo ma non è sufficiente da solo per ottenere un esame diagnostico sufficiente. Inoltre dall'esame microscopico diretto posso anche stabilire se un campione è idoneo oppure no se ne vale la pena per fare tutto il resto dell'iter, ci vuole una decina di minuti; l'esempio classico è l'espettorato, e positivo vuol dire che c'è infezione delle vie respiratorie profonde, massa di muco si trova nelle vie aeree profonde risale fino alle cavità aeree superiori e si contamina con i microrganismi presenti nella cavità, se però c'è un'infezione in atto a livello dele vie respitatorie profonde mi apsetterò di trovare cellule della risposta immunitaria (tanti polimorfonucleati ben visibili) e poche cellule epiteliali, se invece il campione non è stato effettuato correttamente ma è per lo più uno sputo troverò un'alta concentrazione di saliva e di cellule epiteliali. La classificazione di Barkley che assegna proprio un punteggio a seconda della rpesenza di cellule epiteliali o immunitarie.
• Isolamento colturale: prevede la semina del mio campione sugli apprropriati terreni di coltura come agar sangue (nutriente discriminativo per chi fa emolisi alfa, beta o gamma o no), agar cioccolato (per la nesseira), Mc Conkey (terreno selettivo per gli enterobatteri per la presenza di sali biliari, solo gram negativo e differenziale perchè se fermentano o no il lattosio), il sale mannite (per i gram positivi con concentrazioni elevate di cloruro di sodio 7,5 % favorendo la crescita solo degli alofili come stafilococchi);
• Indentificazione: tramite test biochimici;
• Valutazione della suscettibilità del germe isolato ad uno spettro di composti antimicrobici se batteri antibiogramma se sono funghi è un antimicogramma valutando parametri come la MIC (minima concentrazione inibente)
Questo è l'iter diagnostico tradizionale se si vuole andare oltre si fa la tipizzazione per fare studi epidemiologici che hanno una notevole rilevanza che consentono tra le varie cose di stabilire se è scoppiata un'epidemia, effettuata con metodiche molecolari.
Quando viene isolato come facciamo a dire che è uno preciso cioè per esempio che è E. Coli?
Si usano test microscopici questa votla a prtire dalla colonia isolata, per esempio posso valutare se la colonia del germe che ho isoltato è capsulata e sapere se per esempio sono davanti ad un ceppo di streptococcus pneumoniae oppure no può fare la differenza perchè un ceppo capsulato è patogeno e si può visualizzare con l'inchiostro di china o la nigrsosina, perchè appare rifrangente o i ltest del rigonfiamento capsulare con anticorpi specifici per la capsula.
Fondamentalmente l'identificazione si basa su test biochimici ovvero su valutare le proprietà che un batterio ha di assimilare vari zuccheri, se ha un meccanismo ossidativo o fermentativo, se produce determinati enzimi e di solito si fanno delle "gallerie" sono striscioline (API) con tanti pozzettini all'interno dei quali hanno disidratati sul fondo ogni pozzetto un substrato diverso aggiungendo una sospensione del ceppo che voglio analizzare ed in base al tipo di substrato analizzato secondo uno schema ben definito posso arrivare alla identificazione, ora ci sono delle card dispositivi miniaturizzati ancora più piccoli all'interno della quale ci sono vari micropozzetti e si colorano diversamente e messi dentro una macchina che analizza questi pozzetti ed in alcuni casi si arriva ad un'identificazione nel giro di 4 ore.
In alcuni casi si può effettuare identificazione tramite test sierologici diretti o indiretti ma di solito affianca e da informazioni aggiuntive però è sempre necessario effettuare isolamento del microrganismo.
Test molecolari
Se in 4 ore un test biochimico mi dà una corretta identificazione non devo effettuare test molecolari, però ci sono condizioni che richiedono la presenza di test molecolari per esempio per i ceppi che non si coltivano come il bacillo tubercolare che ci impiega 24 ore per replicarsi (cioè per ottenere due cellule ci mette 24 ore) e ci vogliono 4 settimane per una colonia se ho un paziente con tubercolosi ha bisogno prima di 4 settimane di sapere la risposta, si usa per diagnosi veloci per microrganismi lenti nel crescere e quelli che non si coltivano come il micobacterium lebbrae, è un parassita talmente obbligato che a meno che non ho un armadillo non posso far diagnosi se non con test molecolari e per microrganismi coltivabili solo con tecniche di coltura sofisticate e vuol dire fare qualcosa di più che seminare su agar come crescere in linee cellulari per esempio il principale agente eziologico delle infezioni sessualmente trasmesse cioè la clamidia che è un parassita metabolico che ha bisogno di sfruttare l'apaprato della cellula ospite per produrre ATP e replicarsi.
