Per una diagnostica di tipo molecolare dovremmo trovare il materiale genetico del microrganismo da identificare bisogna trovare sequenze target conservate ma variabili tra specie e specie sequenze specie-specifiche e si usano:
Per una diagnostica di tipo molecolare dovremmo trovare il materiale genetico del microrganismo da identificare bisogna trovare sequenze target conservate ma variabili tra specie e specie sequenze specie-specifiche e si usano:
Tecniche basate sull'ibridazione: il principio base è ricercare sequenze specie-specifiche utilizzando una sonda complementare marcandole in modo da rendele evidenti, si denatura, si rende disponibile così all'ibridazione con una sonda marcata con un reporter (enzima per esempio) che rende visibile questo legame specifico target sonda molecolare; i tipi sono:
1. In soluzione
2. Su matrice solida (filtro di nitrocellulosa, nylon etc.)
3. In situ (FISH): direttamente sul campione patologico
il reporter con cui marco la mia sonda è una sonda calda (radioattiva) come vantaggio è sensibile ma ha bisogno di strutture particolari e apparati dedicati per la rilevazione del segnale, altrimenti sonda fressa (non radioattive) prevedono l'incorporazione di nucleotidi marcati (con biotina o enzimi) e che mi consentono di rilevare l'avvenuta ibridazione in chemioluminescenza o con reazione colorimetrica.
Tra i vari esempi molecolari la diagnosi di quei microrganismi dove si rende necessaria una diagnosi molecolare:
a) Accu probe: ha come bersaglio l'RNA ribosomiale (molecola conservata spescie-specifica) si realizza in fase liquida all'interno di una provetta e fatta direttamente sulla colonia, la molecola reporter è l'estere di acridinio che fa sì che l'avvenuta reazione sia evidenziata in chemioluminescenza impressionando una lastra fotografica. Per specie di micobacterium identificabili.
Come si effettua, praticamente per rendere accessibile il materiale genetico dem micobacterium alla sonda la cellula và disgregata e per riuscire a romperlo, perchè ha una struttura parietale molto particolare ecco perchè tempi lunghi di crescita, è sonicarlo con le opportune protezioni per l'operatore per circa 15 minuti, si procede poi all'ibridazione con la nostra sonda rivolta verso l'RNA ribosomiale 16 svedberg marcata con l'estere d'acridinio, si sottopone ad eccitazione e si procede alla rilevazione del segnale, se è avvenuta la reazione si può rivelare con un illuminometro.
Analogo a questo c'è "l'ibridization protection assay" che si basa sul fatto che la sonda legata al suo target protegge il DNA da agenti denaturanti; nello schemino la molecola target, la sonda diretta verso essa e marcata con esteri di acridinio, il DNA a catena singola è suscettibile all'azione di agenti inattivanti, non lo diventa più se legato alla sonda come in questo caso o alla sua sequenza complementare ed è possibile rilevare l'avvenuto segnale, quindi con lo stesso principio sempre di ibridazione verso una sequenza specie-specifica.
• Tecniche basate sulla PCR
• Tecniche basate su microarray.
