Può funzionare però si deve essere consapevoli che ci può essere qualche piccolo inconveniente.
Generazione di cDNA a partire dall’RNA messaggero, che viene clonato nel vettore di espressione plasmidico che deve avere:
legame al ribosoma, terminatore, promotore forte inducibile etc.
Può funzionare però si deve essere consapevoli che ci può essere qualche piccolo inconveniente.
Generazione di cDNA a partire dall’RNA messaggero, che viene clonato nel vettore di espressione plasmidico che deve avere:
legame al ribosoma, terminatore, promotore forte inducibile etc.
E' necessario controllare il corretto orientamento, usando gli enzimi di restrizione, facendo un'analisi in silico al computer per escludere quei cloni che hanno sì ottenuto l'inserto ma in posizione cotnrario che non mi porterà ad un inserimento in frame e alla produzione della proteina.
Per fare ciò devo usare enzimi che non mi tagliano a metà della sequenza perchè con un solo taglio linearizzo e basta, mi ci vuole un enzima o più di uno che taglino in posizioni asimmetrica e che possibilmente taglino al di fuori del frammento nel plasmide.
Studiando a tavolino l'enzima più idoneo effettuo la restrizione sui cloni e controllo quello che ha l'orientamento corretto, in questo modo il corretto orientamento mi assicura che ci sia una corretta espressione della proteina.
La proteina viene espressa come qualunque altra proteina di E. coli
Il problema di far esprimere una proteina di un organismo eucariotico in E. Coli è che magari viene tradotta correttamente ma ci potrebbero essere problemi nel posttraduzione.
Inoltre i batteri non fanno splicing ma infilandoci c-DNA dovrei risolvere il problema.
Però rimane il problema delle modificazioni post-traduzionali (per esempio glicosilazione) che condizionino molto la funzione, Per esempio sulla superfice di candida Albicans ci sono proteine che servono per l'adesione se la mannosil-fosforilazione viene tolta questo processo no nfunziona più, quidni quando voglio fare questa tecnica questo tipo di ospite potrebbe non portare ad una corretta modificazione post-traduzionale della proteine.
Alcune proteine sono state espresse con successo in E.Coli per esempio l'ormone della crescita, l'insulina o l'interferone.
Laddove non si ptesse ottenere una buona proteina si possono usare vettori eucariotici come i lieviti.
Le applicazioni:
• proteine di interesse terapeutico
• proteine di itneresse commerciale (enzimi)
• reagenti per la ricerca di base applicata
• proteine da utilizzare come antigeni per produrre anticorpi
Un'altra cosa importante è la stabilità della proteina ospite che potrebbe essere degradata, la sua localizzazione a volte ci sono le GPI anchor protein che guidano le proteine verso una corretta posizione della parete.
I vantaggi dei procarioti:
• più semplici da manipolare
• rischio di contaminazione virale quasi nullo
• rischio di allergie ridotto
svantaggi:
la conformazione delle proteine forse è uno dei principali aspetti negativi riguardanti la corretta modificazione post-traduzionale.
Applicazioni industriali:
• antibiotici
• proteine ed amminoacidi
• composti commerciali
• vaccini ricombinanti
• produzione alimentare
