Invece di lavorare con il messaggero che è molto instabile e che è velocemente degradato si lavora con il c-DNA ottenibile per retrotrascrizione.
Per l'espressione va bene il c-dna ma se volessi ricercare un gene non posso usarlo perchè mancano gli introni e non sarebbe esattamente uguale al mio gene.
Invece di lavorare con il messaggero che è molto instabile e che è velocemente degradato si lavora con il c-DNA ottenibile per retrotrascrizione.
Per l'espressione va bene il c-dna ma se volessi ricercare un gene non posso usarlo perchè mancano gli introni e non sarebbe esattamente uguale al mio gene.
Se voglio usare una libreria d'espressione è importante che il nostro vettore d'espressione abbia un promotore forte inducibile del quale posso manipolare la trascrizione che abbia una sequenza che riesca a legare i ribosomi ed avere una sequenza terminatrice.
Su tutti questi c-dna solo alcuni esprimeranno la proteina che voglio studiare, una volta effettuata la trasformazione, piastrato, devo fare una replica dei cloni su filtro ed usare anticorpi con i quali fare ibridazione perchè devo vedere quali tra le colonie che hanno c-dna diversi produce effettivamente la mia proteina.
La ricerca delle proteine d'interesse viene fatta attraverso anticorpi specifici. Si utilizzano plasmidi e fagi come vettori, ricavando proteine di fusione.
Affinchè la proteina venga espressa è necessario rispettare alcuni requisiti: il gene di interesse deve essere clonato a valle di un promotore; il frammento di DNA deve essere in frame; è necessario un sito di legame al ribosoma a monte del codone di inizio del gene.
I fattori che influenzano il livello di espressione di un gene clonato sono il numero di copie del plasmide (la sovra-espressione può avere effetti tossici) e la solubilizzazione delle proteine espresse.
Limitazioni per gli eucarioti:
1.I batteri non sono in grado di rimuovere gli introni;
2.Se la proteina funzionale è glicosilata la cellula ospite deve essere una cellula eucariotica.
