Lo studio del proteoma (tutte le proteine di un organismo).
vuol dire conoscere:
• le proteine che sono presenti
• definire la loro struttura
• studiare le interazioni di queste proteine
• come si possono correlarle con la genomica
Il proteoma è un'entità dinamica, perchè cambia continuamente all'interno del solito microrganismo.
Lo studio del proteoma (tutte le proteine di un organismo).
vuol dire conoscere:
• le proteine che sono presenti
• definire la loro struttura
• studiare le interazioni di queste proteine
• come si possono correlarle con la genomica
Il proteoma è un'entità dinamica, perchè cambia continuamente all'interno del solito microrganismo.
Cambia in risposta a:
• fase cellulare
• condizioni ambientali
Metodi usati per la proteomica
• Elettroforesi bidimensionale
• spettroscopia di massa
• array/microarray proteici
Estrazione delle proteine dal campione
Bisogna aver cautela perchè le proteine sono sensibili a vari stress.
Si inizia con il saggiare la presenza della proteina:
• saggio enzimatico
• uso di anticorpi
Ottenuto il lisato cellulare si fanno precipitazioni in centrifuga sequenziali per isolare via, via alcune componenti.
Le cartine della prima dimensione da utilizzare per il punto isoelettrico si selezionano a seconda del range di ph della proteina dove migra (ottengo spot).
La strisciolina nella seconda dimesione è un elettroforesi che le separa per peso molecolare (ottengo bandeggi).
Di questi spot si fa un'analisi comparativa (per esempio tra wild tipe e mutante o tra due ceppi diversi, commensale e virulento e così via).
Si valuta quindi:
• n° di spot
• range di ph
Posso, per restringere il campo, ripetere la bidimensionale con un campo di ph più ristretto.
Esempio pratico.
Studio dello streptococcus pneumoniae (cocco, gram negativo, che dà polmonite ed alcuni casi di meningite).
Con questo studio si è identificata una proteina associata alla resistenza alla penicillina.
Come hanno fatto?
Elettroforesi bidimensionale.
Hanno usato un ceppo wildtipe suscettibile alla penicillina e 2 ceppi mutanti resistenti (due ceppi perchè altrimenti forse si ha un fenotipo resistente legato solo a quel ceppo).
Una volta identificate le proteine candidate (in questo caso solo 2) si è visto che la loro espressione era diversa perchè sovraepsressa in unmutante e non nell'altro.
C’è stata una difficoltà ad attribuire u nruol ochiave comune a tutti i ceppi resistenti.
Allora hanno studiato solo le proteine di membrana con un metodo diverso cioè con l'SDS page.
Si notava una banda solo nei due ceppi mutanti ma non nel wild tipe era coinvolta effettivamente nella resistenza alla penicillina.
Successivamente si sono confermati i risultati con il norther blot, vedendo che quel gene ea effettivamente espresso sol onei mutanti e non nel wild tipe.
Il controllo Rna ci deve essere in tutti i northern blot per valutare se sono stati correttamente caricati i campioni.
La proteina trovata è una subunità facente parte di un trasportatore ABC che è una pompa ad efflusso che permette al microrganismo di buttar fuori i lfarmaco.
Poi hanno tolto la proteina al mutante con un knock-out per vedere se perdeva resistenza o altrimenti inserire il gene nel wold tipe per vedere se l'acquisiva.
I ricercatori hanno preferito il knock-out.
Vedevano che c'era incremento della suscettibilita alla penicillina.
Gli studi di proteomica li posso fare anche in virologia per esempio lo studio tra le interazioni del virus dell'HIV ed i recettori cellulari dell'ospite o lo studio sull'Herpes simplex.
In microbiologia medica è usata per per gli antigeni in modo da allestire test sierologici per saggiare il sangue del paziente.
Vantaggi e svantaggi dell'elettroforesi bidimensionale, in generale la risposta non è così chiara, và ripetuta almeno 3 volte per identificare uno spot , si incide il gel, si preleva, si eluisce e si sequenzia.
Se uno spot non è isolato bene si ripete l'elettroforesi.
Vari metodi per sequenziare le proteine per esempio l'uso di enzimi proteolitici.
Spettrometria di massa
Il frammento preso viene spedito a centri a pagamento.
Il principio prevede che la proteina frammentata venga sequenziata tramite ionizzazione, accelerata in campo magnetico ed in virtù delle loro caratteristiche avranno un determinato percorso.
Cambiando l'intensità del campo magnetico ed analizzati gl ispettri che ne derivano si osservano picchi, ogni picco è un amminoacido.
Poi questi picchi vengono confrontati con i database per avere ulteriori informazioni come la sequenza del sito catalitico.
Cristallografia a raggi X
In base alla struttura valutare le sue possibili interazioni.
