• Isolare un gene specifico e replicarlo: definire la struttura del gene clonato
• Definire la modalità di espressione (spaziale, temporale, induzione ambientale)
• Esprimere il gene in altri organismi per: studiarne la funzione produrre una grande quantità di quella proteina
• Diagnosticare le mutazioni prima che appaia il fenotipo
• Isolare un gene specifico e replicarlo: definire la struttura del gene clonato
• Definire la modalità di espressione (spaziale, temporale, induzione ambientale)
• Esprimere il gene in altri organismi per: studiarne la funzione produrre una grande quantità di quella proteina
• Diagnosticare le mutazioni prima che appaia il fenotipo
La strategia che è alla base per clonare un gene facente parte di un grosso genoma è la seguente:
Tagliare il DNA in piccoli frammenti ed amplificare ogni frammento separatamente in E. Coli o in lievito usando un vettore appropriato. Così facendo creerò una libreria genomica.
I vettori di clonaggio sono piccoli plasmidi o repliconi fagici che hanno uno o più siti di restrizione nei quali DNA esogeno può essere inserito.
I repliconi ibridi sono prodotti usando la DNA ligasi che permette di unire DNA esogeno con quello del vettore tramite le loro estremità compatibili o in alternativa sintetizzando nucleotidi che sono usati come ponti per permettere la compatibilità tra i due frammenti.
Questa tecnica di legame si chiama shotgun cloning e la collezzione di frammenti di DNA contenenti DNA esogeno si chiama libreria genomica.
I plasmidi ed i vettori fagici sono utilizzati nella maggior parte dei casi per clonare piccoli inserti di dimensioni inferiori alle 10 kpb.
Un esempio di vettori per particolari scopi sono i cosmidi che sono composti da DNA plasmidico impacchettabile in un capside fagico (cosmidi di lambda accettano dalle 30 alle 40 kpb).
Il cosmide fagico P1 può accettare più di 100 kpb.
I fagemidi sono ibridi tra pasmidi e fagi che possono esistere come plasmidi o singole eliche di DNA fagico a seconda delle condizioni dell'esperimento.
Le grosse molecole di DNA possono essere clonate in cromosomi di lieviti artificiali (YAC) che possono manterene stabilemente un inserto ci circa 1Mpb
I fagi lambda sono virus che possono infettare i batteri. Il loro maggior vantaggio che danno un'elevata efficienza di trasformazione 1000 volte più efficiente di un vettore plasmidico.
Le estremità terminali del DNA di lambda sono conosciute sotto il nome di siti COS, ognuno di essi è a singolo filamento, della lunghezza di 12 nucleotidi.
Siccome le loro sequenze sono complementari alle altre possono unirsi per formare concatameri.
Nell'assemblaggio dei virioni lambda, due proteine Nu1 e A possono riconoscere i siti COS, guidando l'inserzione del DNA lambda nel capside.
Dopo il riempimento del capside e l'attacco della coda il virione lambda è completo.
Il vettore cosmidico è una combinazione tra il vettore plasmidico ed i siti COS i quali permettono al DNA target di essere inserito nella testa del virus lambda.
Questo da i seguenti vantaggi:
• Alta efficienza di trasformazione
• La possibilità per il vettore cosmidico di portare fino a 45 kb rispetto alle 25 kb del palsmide o del vettore fagico.
