I sistemi vettori possono essere usati per clonare il DNA.
Adesso vediamo BAC e YAC.
Il cromosoma di lievito artificiale (YAC) ha la capacità di trasportare un frammento di DNA di grosse dimensione (superiore ai 2Mb), ma la sua efficienza di trasformazione è molto bassa.
Componenti essenziali del vettore Yac:
• Centromeri (CEN), telomeri (TEL) e sequenze replicanti autonome (ARS) per la proliferazione nella cellula ospite;
I sistemi vettori possono essere usati per clonare il DNA.
Adesso vediamo BAC e YAC.
Il cromosoma di lievito artificiale (YAC) ha la capacità di trasportare un frammento di DNA di grosse dimensione (superiore ai 2Mb), ma la sua efficienza di trasformazione è molto bassa.
Componenti essenziali del vettore Yac:
• Centromeri (CEN), telomeri (TEL) e sequenze replicanti autonome (ARS) per la proliferazione nella cellula ospite;
• Il gene Amp per la resistenza all'ampicillina in modo da poter selezionare il vettore YAC modificato
• Siti di restrizione per enzimi come EcoRI e BamHI
Procedura:
• Il DNA target è parzialmente diferito da EcoRI e il vettore YAC è aperto da Eco RI e BamHI
• Si lega il vettore aperto con il frammento di DNA digerito per formare un cromosoma artificiale
• Trasformazione delle cellule di lievito per ottenere un gran numero di copie
Il primo vettore plasmidico ottenuto è stato pBR322 nel 1976 da E.Coli.
Questo plasmide contiene:
• Origine di replicazione (ORI)
• Due marker di selezione per la resistenza all'ampicillina (gene beta-lattamasi) ed alla tetraciclina (gene tet)
• Una buona quantità di siti di restrizione per l'inserimento di DNA esogeno
Vantaggi:
• 200 copie per cellula di E. Coli
• DNA a doppio filamento
• Tutti i moderni vettori sono basati su pBR322
Nuova generazione di palsmidi: pUC
• Vantaggi ulteriori rispetto al pBR322:
• Più di 1000 copie per cellula
• Taglia piccola di 2,7 kpb più facile da acquisire per E.Coli
• Siti di clonaggio multipli
• Selezione più facile per l'ampicillina e la reazione bianco/blu tramite l'operone lacZ
L'ultimissima generazione di plasmidi sono pGEM e pBluescript con i seguenti vantaggi:
• Molto simili a pUC
• A singolo filamento
• Promotori T7 e T3 (per produzione di RNA)
Principi di clonaggio
• Il vettore agisce come un carrier per il DNA di nostro interesse
• Quando inserisco il c-DNA nel vettore ci sono due possibilità di orientazione possibile con le quali possiamo inserirlo (reverse e forward)
Come faccio a scegliere il tipo di orientamento?
Faccio una restrizione enzimatica
Il pattern che otterrò dai tagli degli enzimi di restrizione ci permetteranno di stabilire lorientamento del DNA
Come seleziono gli enzimi candidati?
• Scarto gli enzimi che fanno un solo taglio
• Devono darmi almeno un taglio a livello dell'inserzione
• Il sito di taglio non deve essere al centro del sito d'inserzione
• E' meglio se da almeno due siti di taglio nel vettore
Una mappa di restrizione è un primo strumento ma poi bisogna usare software per mostrare come clonare in silicio
Step 1: Costruire un complesso vettore /inserto per inserimento in forward
Step 1a: Inserire la sequenza del vettore
Step 1b:Inserire il c-DNA nella direzione di nel vettore alla posizione 294
Step 1c: Annotarsi il complesso vettore/inserto
Step 2: Costruzione del complesso vettore-inserto per un inserimento in reverse
Step 2a: Inserire la sequenza del vettore
Step 2b: Il clone del DNA sarà il prodotto di una PCR e sarà in direzione reverse nel vettore alla posizione 294
Step 2c: Annotarsi il complesso vettore/inserto
Step 3: Selezionare gli enzimi per entrambi gli orientamenti esplicitando l'enzima di nostro interesse
4: il software ci farà una simulazione del gel che otterremo.
