Parto dalle sequenze ITS che sono in banca dati.
Si sceglie uno stretch di 30-35 paia di basi all'interno dell'ITS per ciascuna specie che sarà spottata sul vetrino.
Facciamo in modo tale che la nostra sonda termini sempre una base prima dell'incorporazione della timina (si usa la tecnica APEX).
Parto dalle sequenze ITS che sono in banca dati.
Si sceglie uno stretch di 30-35 paia di basi all'interno dell'ITS per ciascuna specie che sarà spottata sul vetrino.
Facciamo in modo tale che la nostra sonda termini sempre una base prima dell'incorporazione della timina (si usa la tecnica APEX).
• Si estrae il DNA genomico
• Si amplifica la regione ITS vista prima
• Purificazione del prodotto di PCR con colonnine che danno un eluato contenente il frammento puro
• Il prodotto di PCR verrà ibridato sul supporto
• Rilevazione del segnale che mi dirà quale spot acceso a seconda della sonda dove si andrà a legare e quindi identificherò la specie
la rilevazione del segnal è l'APEX (arrayed primer extension) dove un primo vantaggio è che non è richiesta la marcatura del prodotto di PCR.
Questa tecnica è estremamente riproducibile, applicata non solo al campo microbiologico per il papilloma virus, ma per genotipizzazione degli SNP naturalmente rivolta verso regioni polimorfiche.
• Metto il prodotto di PCR
• Metto nucleotidi modificati in modo che abbiano un cromogeno interno
• Il mio frammento di PCR si appaia alla sonda (che termina una base prima della timina) che trova complementare sul vetrino
• Aggiungo una termosequenasi che estende la sonda che avevo posizionato sul vetrino sfruttando come stampo il mio prodotto di PCR, l'unico nucleotide che viene immesso è una timina o un uracile perchè qualsiasi sia la specie microbica tutte le sonde finiscono prima della timina.
Se costruisco quattro sonde diverse per quella regione è come se sul vetrino avessi sequenziata tutta la regione.
Il prodotto di PCR si legherà solo sulle sonde complementari ad esso quindi la termosequenasi lega solo quelle che si legano.
Devo avere il segnale solo nel canale dell'uracile anche se in realtà per ogni sonda ho due spot.
Per ogni sonda nucleotidica mi aspetterò di vedere 2 pallini bianchi.
Nel vetrino ci sono dei controlli di qualità:
• Sonde spottate in doppio
• Controlli interni positivi per verificare che le intensità dei canali delle 4 basi fossero equilibrate e che la reazione APEX avvenisse correttamente
• Campioni analizzati da personale non a conoscenza del ceppo da identificare
Quali condizioni devono essere presenti:
• Segnale presente per i controlli positivi
• Entrambe le sonde devono dare segnale (se ho disegnato 4 sonde attenderò 8 spot perchè ciascuna sonda spottata in duplicato)
• L’estensione deve dare il segnale nel canale delle U se l'ottengo per altri nucleotidi qualcosa non è andato correttamente
Agli angoli se la reazione ha funzionato correttamente, il segnale evidenzaito in verde è il canale dell'uracile, in più ho i 4 spot del campione (in questo caso).
Se vado a leggere a cosa corrisponde quella posizione dove sono comparsi i 4 spot si vedra che ci sono due sonde CPA1 e CPA2 che riconoscono candida parapsilosis.
Vediamo i casi di aspecificità.
Nel caso per esempio ci sono specie geneticamente molto affine, che condividono una buona parte del genoma e che rischiano quindi di darci casi di cross-attività.
Per sempio nel caso di Candida Albicans e Candida Dublinensis (molto simili ma spettro d'ospite diverso perchè il dublinensis è peculiari di pazienti con AIDS) sono vicine dal putno di vista evolutivo e condividono molte sequenze.
In questo caso vediamo i soliti controlli accesi ai 4 angoli, così come il segnale del canale dell'uracile.
Però nel caso di Candida Albicans vedo due sonde specifiche per Albicans ma poi vedo un segnale aspecifico per una sonda per dublinensis.
La discriminazione è comunque possibile perchè se faccio un secondo vetrino per dublinensis quello che succede è che si accendono tutte le sonde per candida dublinensis (sono 4 quindi 8 spot) e nessun segnale per Albicans quindi, nel primo vetrino, posso escludere con certezza che è dublinensis e che è Albicans.
Questo succede spesso anche con i batteri.
A volte l'identificazione fenotipica non coincide con il vetrino perchè il caso di candida parapsilosis e ortopsilosis fenotipicamente sono indistinguibili ma il vetrino è più preciso e ci permette di discriminarle.
Un giorno questo metodo potrà soppiantare l'analisi colturale per la diagnosi di malattie fungine ma al momento è affiancata e basta.
Può la piattaforma microarray fornire altre informazioni contestualmente all’identificazione?
Vedere la suscettibilità cioè poter associare, spottare sul vetrino sonde che riconoscano l'identità del microrganismo insieme a sonde che riconoscano sequenze mutate che danno resistenza dando una risposta più efficace per la diagnosi.
Quindi la risposta è sì la piattaforma può dare risposte ulteriori.
Nei funghi cosa si deve cercare?
Un nesso tra la resistenza ed il genoma quindi trovare le sequenze che danno farmacoresistenza.
Vari meccanismi, alcuni di questi prevedono la mutazione in geni target per esempio le echinocandine (farmaci antifungini) colpisce regioni hot spot cioè regioni più inclini a sviluppare mutazioni dando un fenotipo resistente alle echinocandine, così anche altri farmaci come la flucitosina.
Per tutti è possibile identificare regioni che possono dare resistenza per quel farmaco.
Questi studi faranno da base per disegnare sonde da spottare sul vetrino.
Non solo geni mutati portano ad un fenotipo resistenza ma anche sovraespressione di pompe ad efflusso che portano a farmaco resistenza ci sono dei geni collegati alla produzione di queste pompe sia geni regolatori di queste pompe.
Ma se identifico un ceppo, non è venuto nessuno spot associato alla resistenza posso escludere che sia un fenotipo resistente?
No perchè la farmaco resistenza è un evento multifattoriale e al massimo posso escludere la farmacoresistenza dovuta a mutazione del gene target.
Però se viene lo spot possiamo escludere dalla terapia un determinato farmaco.
Ma posso aggiungere ancora qualcosa a livello di informazioni con il microarray?
Per esempio come reagisce il paziente al trattamento. Farmacogenomica e farmacogenetica, quindi un passo ancora più ambizioso è quell odi poter inserire su qeusto tipo di piattaforma delle sonde che riconoscano dei polimorfismi del paziente associati ad una diversa suscettibilità ad un determinato trattamento, ad un determinato farmaco.
Questo non è fantascienza perchè ci sono polimorfismi nel genoma umano che regolano la farmaco dinamica di una vasta gamma di farmaci tra cui gli antimicotici.
Per esempio geni che codificano l'assorbimento del farmaco o nella distribuzione agli organi o che ne regolano l'escrezione e così via.
Tre esempi sono noti e rilevati polimorfici proprio per quanto riguarda la risposta individuale ad un trattamento di farmaci antimicotici:
• CYP2C9
• CYP2D6
• CYP3A4
Quindi il campione che uso non è solo il DNA del ceppo da analizzare ma anche quello del paziente.
Con metodi diversi a seconda delle nostre possibilità e a seconda del laboratorio in cui siamo abbiamo identificato il microrganismo.
Dopo l'identificazione seguiva la valutazione della suscettibilità ai farmaci (antibiogramma e antimicogramma) ma c'è anche nel caso un laboratorio fosse attrezzato lo step successivo sarebbe quello di effettuare una tipizzazione del microrganismo isolato.
Perchè questo è importante? Perchè c'è una variabilità intraspecifica cioè non tutti i ceppi di una determinata specie hanno le stesse caratteristiche dal punto di vista clinico (virulenza e farmaco resistenza) e se si manifestano anche differenze fenotipiche potrebbero essere un riflesso di differenze genotipiche che se evidenziate possono consetirmi di monitorare un determinato ceppo nel corso di un'infezione.
Quindi è importante perchè l'identificazione del genotipo mi consente di identificare una sorgente di infezione come è successo di dimostrare che nella neonatologia l'infezione avvenuta in un determinato numero di bambini era dello stesso ceppo di quello ritrovato sulle mani del personale infermieristico e ci consente di tracciare il percorso dell'epidemia.
E magari se avviene in una sala operatoria posso bonificare l'ambiente.
E identificare le modalità di trasmissione come per esempio le mani del personale ospedaliero e inoltre di discriminare se è un'infezione esogena cioè se viene dall'esterno o endogena cioè che magari è un germe che ho come commensale e quindi in un momento di alterata attività immunitaria si sviluppa.
Attraverso la genotipizzazione posso monitorare nel tempo un determinato ceppo e valutare se si verifica una selezione o sostituzione di ceppo per esempio durante il corso di una terapia antibiotica o antifungina magari sotto la pressione selettiva del farmaco seleziono un determinato ceppo resistente a quel farmaco o che comunque ha caratteristiche diverse.
Posso effettuare vari studi epidemiologici mettendo in vevidenza fenomeni di microevoluzione cioè il presentarsi di un ceppo non completamente diverso dal precedente ma che ha piccole modificazioni del genoma magari acquisendo determinate caratteristiche fenotipiche.
Per fare questo devo stabilire dei parametri per capire come classificare i vari ceppi.
Possiamo effettuare una classificazione all'interno di uno stesso ceppo in questo modo:
• identici: termine sbagliato perchè due ceppi sono identici se e solo se si mappa tutto il genoma ed in questo caso posso dire che sono dientici se però impiego una metodica di tipizzazione molecolare generalmente faccio un'approssimazione sul genoma perchè non mappo tutto il genoma vedo i polimorfismi e più che identici posso dire non distinguibili con quella metodica
• altamente correlati: cioè simili ma non identici
• moderatamente correlati
• non correlati
Questo grado di relazione genetica viene basato su indici come l'indice di similarità.
Ovviamente questa modificazione del genoma da ceppi che partono non distinguibili fino ad arrivare a ceppi completamente diversi ci arrivano tramite una pressione selettiva.
