Esistono vari metodi per introdurre DNA plasmidico in cellule batteriche:
La procedura standard consiste nel mescolare cellule e DNA plasmidico contenente l’inserto in una soluzione di cloruro di calcio e nel sottoporre le cellule a shock termico
E’ possibile introdurre efficacemente il DNA in batteri mediante la tecnica dell’elettroporazione
Molti metodi sono disponibili per identificare i batteri che contenfono le molecole di DNA ricombinante
Esistono vari metodi per introdurre DNA plasmidico in cellule batteriche:
La procedura standard consiste nel mescolare cellule e DNA plasmidico contenente l’inserto in una soluzione di cloruro di calcio e nel sottoporre le cellule a shock termico
E’ possibile introdurre efficacemente il DNA in batteri mediante la tecnica dell’elettroporazione
Molti metodi sono disponibili per identificare i batteri che contenfono le molecole di DNA ricombinante
La maggior parte dei vettori contengono geni che consentono di selezionare i microrganismi, come la resistenza agli antibiotici
Spesso il DNA esogeno introdotto interrompe un gene codificante per una proteina del vettore e questo consente di distinguere batteri che hanno contengono vettore più inserto da quelli contenenti il vettore vuoto
Alternativamente, il gene clonato può essere evidenziato mediante ibridazione molecolare
ESEMPIO:
Un ceppo di E. coli è stato trasformato con un plasmide che conferisce l’abilità di
1) sopravvivere in presenza di ampicillina
2) sintetizzare l’enzima beta-galattosidasi
I batteri vengono resi competenti, capaci di assumere il DNA plasmidico, ad es. mediante trattamento con cloruro di calcio seguito da incubazioni freddo-caldo-freddo
I batteri vengono risospesi in un terreno liquido nutriente (brodo Luria Bertani, LB) per pochi minuti e successivamente seminati su piastre di LB agar
Per verificare l’avvenuta trasformazione, i batteri vengono fatti crescere su piastre di LB agar, LB agar + ampicillina (LBAmp), e LB agar + ampicillina + Xgal (LBAmpXgal) ed incubati a 37°C.
Applicazioni per la tecnologia del DNA ricombinante:
• Costruzione di librerie genetiche per isolare e caratterizzare u ngene ed il suo prodotto;
• Produzione di proteine usando i vettori d'espressione
• Produzione di: vaccini, ormoni e fattori del sangue etc.
• Nella diagnostica: anticorpi e sonde oligonucleotidiche per analisi prenatali e forensi ad esempio
• Applicazioni terapeutiche: per produzione ormone della crescita, insulina etc.
• Trasferimento di geni per produzione OGM
La possibilità di inserire dna esogeno, per una pianta transgenica per esempio, e con questo sistema sfruttando un plasmide con dentro ilgene della luciferasi, è possibile trasformare una pianta di tabacco è possibile che si vede la trasformazione eprchè la pianta produce luce.
La trasformazione con un gene fluorescente, è la GFP.
Pig glo dove glo sta per gloving, cioè manifestazione di questa fluorescenza.
Il plasmide è caratterizzato da:
• Origine di replicazione
• gene bla (resistente all'ampicillina)
• GFP
• gene AraC che regola la trascrizione della proteina fluorescente in quanto appunto è sotto un promotore che rileva la presenza di arabinosio.
L'operone dell'arabinosio e il plasmide di espressione, in presenza di effettore , arabinosio, parte la trascrizione di AraC e la trascrizione dell'operone.
I due elementi chiave per poter effettuare lo screening dei trasformanti, il gene della resistenza dell'ampicilina ed il gene GFP che emetterà fluorescenza quando esposto a raggi ultravioletti.
• Risospendere le colonie batteriche nella
soluzione contenente cloruro di calcio che le rende competenti
• aggiungere Dna plasmidico pGLO
• Mettere in ghiaccio
• Heat-shock a 42°C per far penetrare il plasmide all'interno delle cellule e mettere in ghiaccio
• Incubare con terreno di crescita (LB) per farle riprendere vitalità dopo queste condizioni stressanti
• piastrare
Si piastrano su tre terreni diversi:
• LB come controllo da solo per accertarsi della vitalità delle cellule
• LB/ampa per selezionare chi è resistente all'ampicillina e che hanno ricevuto il plamside
• LB/ampa/ara per accertare le colonie che danno anche fluorescenza grazie alla presenza di arabinosio
Se LB mi da assenza di crescita non è dettp che non sia avvenuta la trasformazione ma magari il trattamento è stato troppo traumatico.
Vediamo qualche esempio pratico, nel '97 la GFP è stata usata in candida albicans come gene reporter, in questo modo possiamo vedere dove si localizza tale proteina seguirne il suo destino anche nel corso di un'infezione dove si localizza.
Un altro caso usando un tipo di salmonella, inserendo permanentemente una copia del gene GFP.
Per farlo è stata modificata una copia del gene GFP ed espresso nella cellula ospite, E. Coli e Salmonella per esempio, sotto il promotore di lambda.
Creata una cassetta di trasformazione integrata irreversibilmente all'interno del genoma di E.coli e Salmonella.
Scrinando questi trasformati si è visto che la proteina GFP pur non essendo proprio uguale manteneva la sua fluorescenza se messa sotto UV.
Tuttavia nelle due specie batteriche si osservava una leggera differenza nella capacità di rispondere, E.Coli dava un risultato migliore rispetto a Salmonella, era più fluorescente forse lievi modificazioni nella maturazione della proteina.
Questi ceppi potevano essere usati come sensori mettendoli per esempio su terreni con concentrazioni diverse, usandoli in vari modelli sperimentali.
Una delle applicazioni l'impiego di questi agenti nel cotnrollo di qualità.
Nonnostante fossero trasformate con un gene esogeno mantenevano la vitalità e la capacità di esprimere questa proteina.
Un altro esempio è plasmodium falciparum che è l'agente eziologico della malaria ed ha tante forme:
• trofozoita
• merozoita
• sporozoita
tanto da rendere difficile trovare il vaccino anche se ci sono molti sutdi anche europei al riguardo.
Si pensa al vaccino edibile, usando pomodori transgenici.
Altri studi cercano di rilevare proteine rilevanti, che magari fanno parte di un patogeno e che potrebbe essere utile per allestire un vaccino.
Un gruppo indiano ha individuato una proteina ricca di asparagina, di plasmodium, creando
Un costrutto con GFP per vedere dove questa proteina si localizzava in una delle forme della malaria.
Loro l'hanno trovata nel tipo merozoita allo stadio schizzonte.
La mutagenesi sito diretta è una tecnica utilizzata per capire la funzione di una proteina non nota perchè per esempio cambiando in maniera mirata la sequenza di una proteina dando una mutazione non sinonima che magari altera la funzione della proteina.
Se una mutazione cade sulla terza base della tripletta codonica generalmente la proteina rimane invariata altrimenti muta.
Il plasmide viene denaturato, perchè a noi servirà a singolo filamento, che porta nel punto di interesse in questo caso una A.
Per procedere alla mutagenesi adopero un oligonucleotide sintetico che ho generato che è complementare al mio filamento che da un nucleotide diverso, sintetico (nel caso una G).
Sfruttando come stampo il mio dna plasmidico viene esteso questo nucleotide generando due molecole diverse, in una avremo la A complementare alla T che è wild-type invece nel caso della G verrà replicata alla C.
Quinsi se la mutazione cade sulla prima o seconda base avrò una proteina diversa.
Questo eteroduplex lo inserisco in E.Coli, statisticamente metà wild-type e metà mutati ma ci sono kit che aumentano l'efficienza di trasformazione dell'eteroduplex.
La traduzione di quella tripletta non darà più una valina come nell'esempio bensì una treonina a questo putno potrò vedere se la proteina avrà conservato la sua attività se l'avrà persa o se è un enzima se ha aumentato la propria attività.
Altrimenti uso una PCR che all'estremità 5' inserisca una coda per esempio un sito di restrizione o un promotore.
