Le forme larvali di Echinococcus multilocularis multilocularis e di E. granulosus granulosus, cestodi che hanno come ospiti definitivi i canidi (cane, volpe, lupo), possono infettare l’uomo con conseguenze spesso fatali; è pertanto di fondamentale importanza la prevenzione di queste infezioni e quindi l’identificazione degli animali parassitati. Tuttavia la diagnosi di infezione da Echinococcus spp. nell’ospite […]
Archivio Categoria: Tecniche di Laboratorio
Una buona manualità e una strumentazione corretta sono elementi essenziali per maneggiare con sicurezza materiali pericolosi e per la buona riuscita degli esperimenti. Queste conoscenze e abilità, che costituiscono la parte fondamentale di un corso di laboratorio, sono
caratteristiche talmente importanti e apprezzate da essere talvolta definite come “l’arte della sintesi chimica”. Il primo a comprendere il valore della tecnologia in campo sperimentale per una chimica d’avanguardia fu Justus von Liebig, che organizzò già nel 1826 quello che può essere considerato un vero e proprio laboratorio didattico. Al giorno d’oggi le condizioni di lavoro e gli standard di sicurezza sono cambiati radicalmente, tuttavia resta il fatto che manualità, attenzione, diligenza ed esperienza rappresentano ancora la base per condurre un’attività di laboratorio piena di soddisfazioni e sicura – anche con le apparecchiature più moderne.
Molto è stato scritto sul vastissimo campo delle apparecchiature di laboratorio e delle tecnologie sperimentali. Diversi manuali sull’argomento forniscono ottimi consigli su come condurre un esperimento, a partire dall’allestimento della strumentazione fino alle più avanzate tecniche di separazione, come la distillazione o l’estrazione e molte altre tecniche e strumenti.
Un laboratorio con settori di lavorazione campioni in Biosicurezza è progettato e dotato di attrezzature tali da renderlo adeguato allo scopo.
L’accesso al laboratorio viene consentito solo al personale che abbia uno specifico programma di operazione diagnostiche da condurre.
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La diagnosi di certezza di Leishmaniosi si ottiene normalmente con l’osservazione diretta di Leishmania infantum al microscopio ottico, utilizzando materiale proveniente da biopsia linfonodale o sternomielocentesi, strisciato su vetrini e colorato con Giemsa, ma in alcuni casi è possibile non ritrovare il parassita anche se il soggetto è infetto. Inoltre l’identificazione di Leishmania spp. da […]
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Per clonaggio si intende creare ‘copie identiche’ (= CLONI) di un frammento di DNA che possono essere sfruttate per sintetizzare artificialmente delle proteine (insulina, aldosterone etc.). Frammento di DNA Il frammento di DNA da clonare viene isolato e tagliato con un opportuno enzima di restrizione. Il gene isolato viene inserito in un vettore di clonaggio, […]
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Le reazioni di amplificazione messe a punto per la diagnosi delle malattie parassitarie utilizzano come bersaglio sequenze di DNA parassita-specifiche appartenenti a geni codificanti per proteine di superficie, antigeni somatici, prodotti enzimatici ovvero sequenze appartenenti al rDNA. A seconda del template, possono essere usati primers altamente conservati (come nel caso del rDNA) oppure primers disegnati […]
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Il sequenziamento del DNA consiste in una reazione di PCR modificata in cui viene inserito un reagente in più, cioè una miscela di 4 terminatori marcati con quattro diversi fluorocromi e il cui template è rappresentato dal prodotto di PCR purificato. Un terminatore è un – dideossi -nucleotide (ddNTP), cioè un nucleotide con un atomo […]
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Che cos’è una reazione a cetena della polimerasi Il suo nome originale è Polymerase Chain Reaction, abbreviata in PCR. Consiste in una metodica di Biologia Molecolare che permette l’amplificazione di una regione specifica di DNA mediante cicli ripetuti di replicazione a temperature differenti. La PCR è stata messa a punto negli anni ’80 da Mullis […]
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La metodica classica di estrazione del DNA da campioni biologici è l’estrazione fenolica. Come avviene l’estrazione di acidi nucleici Si deve preventivamente ottenere la lisi cellulare del campione mediante frantumazione manuale oppure tramite trattamento con il freddo; si utilizzano solventi chimici (SDS, Urea, Mercaptoetanolo, Proteinasi K) al fine di degradare lipidi e proteine. Dopo alcuni […]
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Nei primi passaggi di purificazione delle proteine è spesso utile impiegare tecniche non cromatografiche di frazionamento selettivo, ad alta capacità. Frazionamento con sali. Si basa sulla precipitazione delle proteine per ‘salting out’. I sali ad alte concentrazioni tendono a diminuire la solubilità proteica attraverso meccanismi piuttosto complessi. Si sa che gli ioni (anioni e cationi) liberati […]
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La localizzazione delle proteine da purificare influenza le metodiche che possono essere impiegate per ottenere un estratto grezzo di partenza. Per le proteine solubili extracellulari, cioè secrete in fluidi extracellulari (brodo di coltura nel caso di microrganismi; oppure fluidi biologici quali sangue, latte, urina etc.) in genere basta concentrare il liquido, perché la quantità di proteine […]
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Per la determinazione della concentrazione totale di proteina in una miscela sono disponibili molte tecniche, di cui descriviamo le più comuni. Parecchi di questi metodi non forniscono un concentrazione assoluta ma relativa rispetto ad uno stock di proteina standard che viene usata per la preparazione di una retta di taratura (spesso, per il basso costo, la facile reperibilità etc. si utilizza come standard l’albumina da siero bovino, o BSA).