Archivio Categoria: Biotecnologie Microbiche

La frequenza dei cloni metagenomici che esprimono una qualche attività è bassa. Per esempio nella ricerca di cloni lipolitici derivati dal German soil, soltanto 1 su 730 mila cloni mostra attività. La scarsità dell'attività dei cloni necessita perciò di uno sviluppo di uno screening efficiente e di una selezione per scoprire nuove molecole o attività.

Tutto è partito dalla produzione di una libreria di mutanti random prodotta utilizzando un trasposone. Per produrla si usano trasposoni della famiglia TN10. In un plasmide è presente questo trasposone che ha sequenze "IS" al 3' ed al 5', al suo interno c'è una cassetta che codifica per una proteina che da resistenza alla spectinomicina. […]

La metagenomica è la disciplina scientifica che ha come obiettivo la scoperta di nuovi organismi o geni in grado di produrre combustibile, rilevare metalli e bonificare siti. Si basa sul sequenziamento del genoma di microrganismi, la cui analisi effettuata nel proprio habitat naturale viene definita metagenoma. La maggior parte di questi organismi sono di difficile […]

Può funzionare però si deve essere consapevoli che ci può essere qualche piccolo inconveniente. Generazione di cDNA a partire dall’RNA messaggero, che viene clonato nel vettore di espressione plasmidico che deve avere: legame al ribosoma, terminatore, promotore forte inducibile etc.

Invece di lavorare con il messaggero che è molto instabile e che è velocemente degradato si lavora con il c-DNA ottenibile per retrotrascrizione. Per l'espressione va bene il c-dna ma se volessi ricercare un gene non posso usarlo perchè mancano gli introni e non sarebbe esattamente uguale al mio gene.

Esistono vari metodi per introdurre DNA plasmidico in cellule batteriche: La procedura standard consiste nel mescolare cellule e DNA plasmidico contenente l’inserto in una soluzione di cloruro di calcio e nel sottoporre le cellule a shock termico E’ possibile introdurre efficacemente il DNA in batteri mediante la tecnica dell’elettroporazione Molti metodi sono disponibili per identificare […]

I sistemi vettori possono essere usati per clonare il DNA. Adesso vediamo BAC e YAC. Il cromosoma di lievito artificiale (YAC) ha la capacità di trasportare un frammento di DNA di grosse dimensione (superiore ai 2Mb), ma la sua efficienza di trasformazione è molto bassa. Componenti essenziali del vettore Yac: • Centromeri (CEN), telomeri (TEL) […]

• Isolare un gene specifico e replicarlo: definire la struttura del gene clonato • Definire la modalità di espressione (spaziale, temporale, induzione ambientale) • Esprimere il gene in altri organismi per: studiarne la funzione produrre una grande quantità di quella proteina • Diagnosticare le mutazioni prima che appaia il fenotipo